大黄具有泻下攻积、清热泻火、活血化瘀等功效, 现代研究表明, 大黄中含有蒽醌衍生物、苷类化合物、鞣质类、有机酸、挥发油、多糖等化学成分, 同时具有抗菌抗病毒、抗炎祛痰、泻下、保护胃黏膜、保肝利胆、利尿改善肾功能、降血压、降脂减肥、抗肿瘤等药理作用[1]。
目前, 对大黄的活性组分离提取纯化的研究较多, 如明胶沉淀法、聚酰胺法、葡聚糖凝胶法等, 但这些方法操作过程复杂, 处理能力有限、成本高。近年来, 大孔吸附树脂技术由于操作简单、成本低等特点, 在中药的提取、分离纯化方面得到了广泛的应用, 不断的受到研究学者的重点关注。本实验通过研究D101树脂对大黄蒽醌类组分的吸附性能和纯化工艺, 而获得较高纯度的组分, 从而为大黄蒽醌类组分的分离纯化提供参考。
1 仪器、试剂与试药
1.1 仪器
Agilent 1220型高效液相色谱仪 (安捷伦科技有限公司) , KQ-250B型超声波清洗机 (昆山市超声仪器有限公司) , 电子天平 (北京科学仪器有限公司) , 旋转蒸发器RE-2000A (巩义市予华仪器有限公司) , SHZ-D循环水式真空泵 (巩义市予华仪器有限公司) , 电热恒温水浴锅 (北京市永光明医疗仪器厂) 。
1.2 试剂与试药
大黄素对照品 (中国药品生物制品检定所) ;D101大孔吸附树脂;磷酸、乙醇、甲醇、盐酸、三氯甲烷 (均为分析纯) , 色谱甲醇;水为娃哈哈纯净水;大黄药材购自西安市万寿路药材市场, 经鉴定为蓼科植物唐古特大黄Pheum tanguticum Maxim.ex Balf.的干燥根及根茎。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 大黄提取液的制备
称取50g大黄粗粉, 加入10倍量80%的乙醇回流提取3次, 每次0.5h, 滤过, 合并滤液, 滤液减压回收乙醇, 最终得180m L浓缩液, 相当于0.278g/m L的生药材。
2.1.2 供试品溶液的制备
精密量取大黄提取液0.6m L, 加入8%盐酸液10m L, 超声2min, 再加入三氯甲烷10m L加热回流1h, 放冷, 置分液漏斗中, 分取三氯甲烷层, 酸液层用三氯甲烷萃取3次, 每次10m L, 合并三氯甲烷液, 减压回收溶剂, 残渣加甲醇溶解定容至10m L容量瓶中, 即得[2]。
2.1.3 对照品溶液的制备
精密称取0.001g大黄素, 用甲醇溶解后定容至10m L, 制成100ug/m L的大黄素对照品溶液。
2.2 含量测定方法[3]
2.2.1 色谱条件色谱柱:
Ultis IlTMXB-C18 (10×250mm, 5um) ;流动相:甲醇-0.1%磷酸水溶液 (80:20) ;检测波长:254nm;流速:1m L/min;柱温:室温。在此条件下, 大黄素的分离良好。
2.2.2 标准曲线的制备及线性范围的考察
分别精密吸取混合对照品溶液4.0u L、8.0u L、10.0u L、12.0u L、16.0u L、20u L, 按“2.2.1”项下色谱条件注入液相色谱仪中, 记录色谱峰面积, 以进样量X (ug) 为横坐标, 相应的峰面积A为纵坐标, 绘制标准曲线, 结果如下:
得标准曲线A=507.24X-0.4699, R=0.9998 (n=6) , 表明大黄素在0.2ug-2.0ug范围内, 线性关系良好。
2.3 大黄总蒽醌的分离与纯化工艺
2.3.1 大孔吸附树脂的预处理用适量蒸馏水漂洗, 再用
95%乙醇浸泡24小时, 然后用蒸馏水将树脂冲洗至无醇味, 用2倍于树脂体积的5%盐酸浸泡2小时, 用蒸馏水冲洗至中性;再用2倍树脂体积的5%氢氧化钠浸泡2小时后用水洗至中性, 备用。
2.3.1大孔吸附树脂的预处理用适量蒸馏水漂洗, 再用95%乙醇浸泡24小时, 然后用蒸馏水将树脂冲洗至无醇味, 用2倍于树脂体积的5%盐酸浸泡2小时, 用蒸馏水冲洗至中性;再用2倍树脂体积的5%氢氧化钠浸泡2小时后用水洗至中性, 备用。
2.3.2测定静态的吸附量[4,5,6]取5mL预处理过的D101树脂, 置100m L具塞锥形瓶中, 量取10m L大黄提取液, 加入锥形瓶中, 每间隔30 min振荡3 min (6次) , 放置过夜, 过滤, 吸取滤液少量, 对滤液和上样液进行HPLC测定大黄素含量, 计算吸附量为0.4048mg/m L吸附率为80.31%。
2.3.3测定动态的吸附量[4,5,6]取5m L预处理过的D101树脂, 湿法装柱 (20cm×1.5cm) , 量取10m L大黄提取液上柱, 流速1m L/min, 收集流出液, 用HPLC法测流出液中大黄素的含量, 计算吸附量为0.3816mg/mL吸附率为72.26%。
2.3.4上样液浓度对吸附量的影响[4,5,6]取4份5mL预处理过的D101树脂分别装柱 (20cm×1.5cm) , 分别加入含生药量为0.1315、0.0658、0.044、0.0329g/m L大黄提取液各20m L, 调节流速为lm L/min, 分别收集流出液, 用HPLC法测流出液大黄素有含量, 计算吸附量和吸附率。结果见表2。
结果表明, 在大黄提取液浓度较低时, 树脂的吸附能力随着提取液浓度的降低而降低。当提取液浓度为0.0658g/m L时, 吸附率最高, 所以选择此浓度。
2.3.5泄露曲线的考察[4,5,6]取20mL预处理过的D101树脂吸附装柱 (20cm×1.5cm) , 以浓度为0.0658mg/m L大黄溶液进行动态吸附, 分段收集流出液, 每份15m L, 共收集15份, 取样测定流出液中大黄素的含量。从第5份大黄素开始明显泄露, 所以确定大黄提取液最大上柱体积为60mL, 即3倍的树脂体积。
2.3.6洗脱剂的选择[7]取3份20mL预处理过的D101树脂分别装柱, 按上述所确定的吸附条件上样, 上样结束后, 分别用100m L50%、70%、90%的乙醇洗脱树脂柱, 收集洗脱液, 取样测定流出液中大黄素的含量, 计算洗脱率;另外将洗脱液回收乙醇, 干燥, 称定重量, 计算出膏率。
结果表明, 在一定范围内, 洗脱剂的浓度越高, 对大黄素的洗脱能力越好, 出膏率也越大, 综合各因素, 选用70%的乙醇为洗脱剂。
2.3.7洗脱曲线的考察[8]取20mL预处理过的D101树脂装柱, 调节流速为lm L/min, 量取60m L大黄提取液上样, 上样结束后, 用70%的乙醇洗脱, 分段收集流出液, 每份20m L, 共收集14份, 分别取样测定流出液中大黄素的含量。前4份洗脱液中大黄素的含量经计算85%, 故确定洗脱体积的用量为4倍的树脂体积。
2.4 验证试验
取3份20m L预处理过的D101树脂分别装柱, 调节流速为lm L/min, 分别加入60m L大黄提取液进行动态吸附, 然后用10倍量的水洗至近澄清, 最后各用80m L70%的乙醇以lm L/min的流速洗脱。计算D101树脂对大黄蒽醌的吸附量、吸附率、解析率、浸膏收率。结果见表-3
从表-3中可以看出, D101树脂分离纯化大黄蒽醌类组分的方法稳定可行。
3 结语
D-101型大孔吸附树脂是一类苯乙烯型非极性共聚体, 适用范围比较广, 对于不带极性或弱极性的有机化合物, 吸附能力强。大黄蒽醌类组分极性较弱, 适宜选用此种分离、纯化方法。本研究中采用D101大孔吸附树脂对大黄蒽醌组分进行分离与纯化, 吸附条件为:上样液浓度为0.0658g/m L, 最大上样液体积为3倍树脂体积, 洗脱剂为4倍量树脂体积的70%的乙醇。通过树脂的富集纯化的验证性实验, 测得总蒽醌浸膏收率为13.21%, 表明该树脂纯化大黄总蒽醌的工艺可行。
摘要：目的研究D101大孔树脂对大黄蒽醌类组分的吸附性能和纯化工艺。方法以大黄总蒽醌中的代表成分大黄素为考察指标, 采用HPLC法测定大黄素的含量, 考察D101大孔树脂对大黄蒽醌类组分的纯化工艺及参数。结果D101大孔吸附树脂对大黄蒽醌的适宜交换吸附条件为:上样液浓度为0.0658g/m L, 上样液的最大量为3倍树脂体积, 4倍量树脂体积的70%乙醇为洗脱剂。结论 通过树脂的富集纯化, 测得总蒽醌浸膏收率为13.21%, 表明该树脂纯化大黄总蒽醌的工艺可行。
关键词：D101大孔吸附树脂,大黄,大黄素,HPLC,分离纯化
参考文献
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[2] 国家药典委员会·中华人民共和国药典 (一部) [M].北京:中国医药科技出版社, 2010:22.
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