视网膜血管内皮细胞

视网膜血管内皮细胞（精选8篇）

视网膜血管内皮细胞 第1篇

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器

人视网膜血管内皮细胞(human retinal endothelial cells,h RECs)购于美国Sciencell公司,青霉素、链霉素和乙二胺四乙酸为美国Hyclone公司产品,Enzyme-乙二胺四乙酸购于美国Sigma公司,二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)和噻唑蓝[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]购自美国Gibco公司,RNA提取试剂盒、反转录试剂盒lipo2000购自美国Invitrogen公司,增强化学发光法(enhanced chemiluminescence,ECL)试剂购自瑞典Amersham biociences公司,兔抗人VEGF和TGF-β1抗体、标记免疫球蛋白G二抗辣根过氧化物酶购自美国Cell signaling公司,Western blot检测试剂盒购自上海Beyotime公司,DNA扩增器和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪为美国ABI公司产品,其他常见的试剂购于上海生物工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 h RECs培养和分组

将h RECs接种在不含胎牛血清,含5.5 mmol/L葡萄糖的达尔伯克必需基本培养基(dulbecco's minimum essential medium,DMEM)中,(含100 u/ml青霉素和100μg/ml链霉素),第8代细胞数达1×106个/cm2,将其随机分为4组:①对照组:正常情况下细胞培养;②高糖组:在高糖环境下诱导培养72 h后,h RECs在33 mmol/L葡萄糖的微血管内皮细胞培养基增殖;③转染组:转染mi R-200b的REC-5细胞在高糖条件下培养;④抑制剂组:转染mi R-200b抑制剂的REC-5细胞在普通条件下培养。

1.2.2 mi R-200b及抑制剂转染

mi R-200b及抑制剂由在上海吉玛公司模拟合成。其序列分别为5'-UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGAC-3'和5'-AU UAUGACGGACCAUUACUACUG-3'。在普通条件和高糖环境下,用转染液lipo 2000将mi R-200b抑制剂和mi R-200b转染h RECs。h RECs在增殖期,接种于3×106个/cm2的6孔培养板,37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中培养12 h,将混有mi R-200b和抑制剂的lipo 2000转染液添加到细胞培养8 h,用10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链式反应

用Trizol从h RECs中提取m RNA,应用实时荧光定量PCR检测目标基因的表达。反应条件为:52℃预变性60 s,90℃变性30 s,58℃退火50 s,72℃延伸35 s,共35个循环。见附表。

1.2.4 MTT

细胞接种于96孔板后,取5 g/L MTT溶液20μl添加至每孔,孵育4 h。除上清液后,加入150μl DMSO,10 min后,采用紫外分光光度仪测570 nm处吸光度值,计算细胞增殖率。

1.2.5 Western blot检测

从超声处理的提取液中提取h RECs总蛋白。10 000 r/min离心15 min,取上清液转移到新的Eppendorf管,置于-20℃冰箱冷冻存放。蛋白质由10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移到聚偏二氟乙烯膜膜,用5%脱脂奶封闭2 h,与VEGF抗体(1∶1 000)或TGF-β1抗体(1∶2 000)在4℃共同孵育一整夜;用聚丁二酸-共-对苯二甲酸丁二醇酯漂洗后,膜被进一步与羊抗兔二抗体(1∶2 000)一起孵育30 min,用化学发光剂显像。IPP6.0软件分析Western blot条带。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较用单因素方差分析,两两比较用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 h RECs中mi R-200b表达

实时荧光定量PCR检测h RECs中mi R-200b表达,结果显示,逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)的扩增曲线、熔解曲线稳定,提示mi R-200b的异物特异性好,能较好地检测h RECs中mi R-200b的表达。见图1~2。

各组mi R-200b表达比较,经单因素方差分析,差异有统计学意义(F=22.511,P=0.000)。各组mi R-200b表达比较,经LSD-t检验,抑制剂组和高糖组中mi R-200b表达低于对照组,差异有统计学意义(t=3.972,P=0.003),转染组中mi R-200b表达高于高糖组,差异有统计学意义(t=3.171,P=0.010)。见图3。

2.2 mi R-200b对h RECs细胞增殖的影响

MTT法检测在高血糖环境下mi R-200b对h RECs细胞增殖的影响,结果发现,各组h RECs增殖率比较,经单因素方差分析,差异有统计学意义(F=7.286,P=0.011)。各组mi R-200b表达比较,经LSD-t检验,抑制剂组和高糖组中h RECs增殖率高于对照组,差异有统计学意义(t=5.561,P=0.001),转染组中h RECs增殖率低于高糖组,差异有统计学意义(t=2.383,P=0.039)。表明mi R-200b降低可以促进血管内皮细胞增殖,而增高能抑制靶细胞视网膜血管内皮细胞增殖。见图4。

2.3 mi R-200b对h RECs内VEGF和TGF-β1m RNA表达的影响

采用实时定量PCR反应检测在高血糖环境下mi R-200b对h RECs中VEGF和TGF-β1 m RNA的表达影响。各组h RECs的VEGF和TGF-β1 m RNA表达比较,经单因素方差分析,差异有统计学意义(F=13.801和8.72,P=0.003和0.007)。各组h RECs的VEGF和TGF-β1 m RNA表达比较,经LSD-t检验,抑制剂组和高糖组中h RECs的VEGF和TGF-β1m RNA表达高于对照组(t=4.733和6.551,P=0.000和0.001),转染组中h RECs的VEGF和TGF-β1m RNA表达低于高糖组(t=4.301和6.913,P=0.025和0.010)。见图5。

2.4 mi R-200b对h RECs中VEGF和TGF-β1蛋白表达的影响

Western blot测定h RECs转染mi R-200b后对VEGF和TGF-β1蛋白及m RNA的表达的影响。各组h RECs的VEGF和TGF-β1蛋白表达水平比较,经单因素方差分析,差异有统计学意义(F=20.131和16.303,P=0.000和0.001)。各组h RECs的VEGF和TGF-β1蛋白表达表达比较,经LSD-t检验,抑制剂组和高糖组h RECs的VEGF和TGF-β1蛋白表达高于对照组,差异有统计学意义(t=3.443和4.121,P=0.021和0.015),转染组中h RECs的VEGF和TGF-β1蛋白表达低于高糖组,差异有统计学意义(t=5.113和7.214,P=0.023和0.001)。研究表明,高糖环境可以抑制h RECs中mi R-200b,促进VEGF、TGF-β1 m RNA和蛋白的表达,进一步引起视网膜血管内皮细胞结构和功能紊乱。转染mi R-200b后靶向细胞促进其表达,并下调VEGF、TGF-β1 m RNA和蛋白的表达,从而改善糖尿病视网膜病变。见图6~7。

1:对照组;2:抑制剂组;3:高糖组;4:转染组

3 讨论

糖尿病视网膜病变是一种常见的糖尿病微血管并发症,可导致视网膜微血管进行性损伤。其严重影响患者的身心健康,给社会带来沉重经济负担[18,19]。尽管医学不断进步,治疗效果仍不满意。高血糖环境可导致糖尿病患者视网膜血管内皮细胞发生一系列内分泌代谢变化。高血糖是导致糖尿病并发症发生、发展的重要因素,可引起器官结构和功能紊乱[20,21]。视网膜血管内皮细胞结构和功能改变是糖尿病慢性过程的主要病理机制。高血糖可导致视网膜血管内皮细胞功能障碍,包括通过调节内皮素和血管内皮生长因子促进细胞增殖和新生血管形成[22,23]。

mi RNA参与各种生理过程,包括细胞增殖、凋亡、信号转导、分化、代谢和激素分泌,以及维持胚胎干细胞的潜能。其能调节人体的生长发育,使人体适应环境。

目前,有关mi RNA的大量研究主要集中在其对肿瘤发生、发展、侵袭、转移和其他生物特征的作用上[9],而有关mi RNA在糖尿病视网膜病变中的作用报道较少。

mi R-200b参与调节糖尿病的发生、发展[10],但其在糖尿病视网膜病变研究中的作用尚未阐明。通过h RECs培养和高糖环境处理,本研究证实,在高糖状态下h RECs中mi R-200b水平下降,进一步表明细胞可以通过转染mi R-200b抑制h RECs异常增殖。

VEGF有多种亚型,通过结合相应受体发挥作用。大部分相应受体位于内皮细胞表面,VEGF特异性结合可改变血管通透性,促进血管形成。因此,对于早期的糖尿病视网膜病变,血管内皮生长因子可通过调节改变血管通透性;晚期其参与糖尿病视网膜新生血管形成[24,25]。TGF-β1是一种多肽生长因子,广泛分布于众多细胞中,具有多种生物学功能。其调节细胞生长、分化和迁移,调节细胞外基质的合成和分泌,并参与免疫调节,在糖尿病视网膜病变的形成过程中发挥重要的作用。TGF-β1还是一种促细胞增殖的重要调控因子,能上调整联蛋白的表达,促进细胞外基质分泌,调节细胞与基质的相互作用,趋化巨噬细胞促进新生血管形成和成纤维细胞生长。其通过抑制抗体生成和淋巴细胞增殖,抑制CTL、NK、LAK细胞的细胞毒作用,发挥免疫抑制作用[26,27]。目前,有关TGF-β1在糖尿病视网膜病变中作用的研究未见报道。因此,笔者重点研究mi R-200b对视网膜血管内皮细胞的影响。经证实,高糖环境下通过抑制mi R-200b表达可促进VEGF、TGF-β1 m RNA和蛋白的表达,促进内皮细胞增殖和新生血管形成,导致视网膜病变。通过上调mi R-200b表达可以减少VEGF、TGF-β1 m RNA和蛋白的表达,改善血管内皮细胞的结构和功能,延缓DR的进展。

综上所述,通过mi R-200b改变VEGF和TGF-β1表达,可导致视网膜血管内皮细胞的生长和增殖,可以延缓DR的进展。

摘要：目的 探讨高糖环境下micro RNA-200b(mi R-200b)影响人视网膜血管内皮细胞(h RECs)功能的作用机制。方法 在正常和高糖环境下培养h RECs,实时荧光定量聚合酶链式反应检测mi R-200b表达。分别用mi R-200b和特异性mi R-200b抑制剂转染h RECs,并且用噻唑蓝法检测高糖环境下mi R-200b对h RECs增殖的影响。用Western blot测定h RECs转染mi R-200b和mi R-200b抑制剂后对血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)蛋白和m RNA的表达的影响。结果 高糖组VEGF、TGF-β1 m RNA和蛋白表达较对照组增加(P<0.05)。转染mi R-200b后,h RECs中mi R-200b表达升高,而VEGF、TGF-β1 m RNA和蛋白的表达降低。与高糖组比较,h RECs增殖受到抑制(P<0.05)。结论 mi R-200b通过改变VEGF和TGF-β1的表达,调节h RECs生长和增殖,延缓糖尿病视网膜病变的发生、发展。

视网膜血管内皮细胞 第2篇

【关键词】肺肿瘤；肺上皮样血管内皮细胞瘤;病理学；免疫组织化学

【中国分类号】R734.2【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）11-0019-02

【Abstract】Objective: To study the clinical and pathological characteristics, diagnosis and differential diagnosis of pulmonary epithelioid hemangioendothelioma(PEH). Methods: Analyze the clinical manifestations, pathological morphology and immunohistochemical features of PEH after diagnosing three cases and reviewing some literatures. Results: Three cases were middle-aged female. The gross presentation was solitary or multiple nodules in lung. Histologically, the tumors were characterized by oval to round nodulous proliferation, mucocartilagnoid background, centrol hypercellular and sclerotic area, peripheral hypocellular area, invasion to adjacent bronchiole and alveolar. Oval to round epithelioid cells with intracytoplasmic vacuoles, signet-ringoid sometimes, suggested the formation of single-cell vascular, the characteristic of epithelioid hemangioendothelioma. The tumor cells were strongly positive for factorVⅢ, CD31, CD34 and vimentin, negative for TTF-1, CK(pan) and EMA. Conclusion: PEH is a rare low/medium-grade m alignant tumor. Surgery is the main therapy, supplemented by radiotherapy and chemotherapy.

【Key words】lung tumor ；pulmonary epithelioid haemangioendothelioma；pathology；immunohistochemistry

肺上皮样血管内皮细胞瘤（pulmonary epithelioid haemangioendothelioma ，PEH）是一种罕见类型的肺脏肿瘤、发病率低 。临床上常常误诊、漏诊，病理诊断有一定困难。PEH病例国内外报道不多［1］。本文总结我院近年来诊治的3例PEH，并复习相关文献。报告如下。

1 福建省立医院病理科

1 临床资料 :例1：女性,50岁，无明显诱因持续胸闷、咳嗽2个多月，无咳痰、咳血；CT提示左肺上、下叶及壁层胸膜有多发性结节，部分胸膜皱缩。送检肺组织大小约7.5cmx3.0cmx2.2cm,切面肺实质中见散在多发性结节，灰白色或褐色，结节直径大小约0.3－2.0cm，界限清楚，切面质地中等，部分区域钙化质硬。镜下肺内散在富有黏液样基质的病灶，大小不一，小者仅有几个或十几个细胞组成围绕在小血管周、支气管树周或泡间隔中。病灶周边细胞丰富，中央细胞稀少。病灶部分瘤细胞有轻度异型性，未见核分裂像及坏死，部分瘤细胞胞浆有空泡形成。免疫组织化学染色CD34、CD31及FⅧ阳性，TTF－1、CK(pan),EMA阴性。诊断肺上皮样血管内皮瘤。例2，女性，46岁，因体检发现右肺占位性病变1周入院，X线及CT检查见右下肺叶孤立性结节性肿物，临床诊断为右下肺肿物性质待查。术中送检肺组织大小约3.0cmx2.0cmx1.2cm行冰冻诊断，肺组织切面见孤立性结节，灰褐色，结节直径大小约0.8cm，界限清楚，质中。术中冰冻切片诊断为肺恶性肿瘤，考虑腺癌。常规切片镜下见一个圆形的结节，间质纤维化，中央部分区域坏死。肿瘤细胞卵圆形，呈上皮样，胞浆丰富嗜双色性，瘤细胞内见空泡，呈印戒样。核分裂象少见。 免疫组织化学染色CD34、CD31及FⅧ、vimentin阳性，TTF－1、CK(pan),EMA阴性。诊断肺上皮样血管内皮瘤。例3，女性，56岁，反复咳嗽、咳血1年余，加剧3天入院。X线及CT检查示两肺分布大小不等的类圆形小结节，性质待定。肝脏分布大小不等的类圆形低密度灶，增强扫描呈"牛眼状"强化，提示为肝、肺转移癌。临床诊断为肝、肺结节原因待查，考虑为转移癌。在CT引导下行肺脏结节穿刺活检。送检穿刺组织5条，总体积大小约1.0cmx0.8cmx0.5cm。镜下见瘤细胞间的间质由丰富的基质组成，为粘液软骨样背景。肿瘤细胞异型性小，呈圆形，具有上皮样形态，胞浆丰富嗜酸性，瘤细胞内见空泡，呈印戒样，这提示单细胞血管形成趋势。部分瘤细胞核内见胞浆包涵体。核分裂象少见。免疫组织化学染色CD34、CD31及FⅧ、vimentin阳性，TTF－1、CK(pan),EMA阴性。诊断肺上皮样血管内皮瘤。

2 讨论

肺上皮样血管内皮细胞瘤（PEH）是十分罕见的疾病［1、2］，是一种低到中级别恶性的血管肿瘤，是由包埋于粘液透明性基质中的短索状和巢状的上皮样内皮细胞组成。1975年，Dail等［3］首先报道了肺上皮样血管内皮瘤（PEH）,但由于对肿瘤的组织起源不清楚，肿瘤细胞又有在肺泡内生长的特性，当时认为是肺泡细胞癌的亚型，并称之为血管内支气管肺泡瘤。近年来随着电镜及免疫组织化学方法的应用，明确了其血管源性肿瘤的本质［4］。证实此瘤起源于血管内皮细胞，和肺外上皮样血管内皮瘤一样具有相似的上皮样和内皮分化。以往认为该瘤是中间型并有恶性倾向的肿瘤，在2002年WHO软组织肿瘤分类中将其定为恶性［5］。

2.1 诊断

2.1.1 临床特点： PEH的患者大多数是白种人，80%为女性。年龄范围12-61岁。由于PEH临床症状缺乏特异性，故极易被漏诊、误诊。PEH临床表现通常是无痛的，一半患者是无症状的。有症状的患者表现为胸膜炎性胸痛、咳嗽、气短、咯血及杵状指。有的患者可表现为肺泡出血或血栓栓塞性疾病。影像学检查：胸部X光拍片、CT扫描特征性地显示肺部结节，结节大小约0.8-2.5cm，结节为孤立性或多发性，偶见钙化。

2.1.2 病理学特点：PEH最常见的大体表现是肺脏孤立性或多发性结节，结节大小不等，直径0.3－2.5m、界限清楚，灰白色或褐色，偶尔伴有黄色斑点。质地中等，切面均匀一致，部分区域钙化质硬。显微镜下组织学检查：低倍显示圆到卵圆形的大小不等结节，典型的有中心硬化、细胞减少区和外周的富于细胞区。有些结节中央为无定型嗜酸性物质或凝固性坏死，坏死中心有时可能钙化和骨化。肿瘤典型地播散至邻近的细支气管和肺泡腔，呈微息肉样并可见通过肺泡壁的肺泡孔。广泛的淋巴道播散可类似转移癌。细胞间的间质由丰富的基质组成，早期可见粘液软骨样肿瘤背景，部分区域粘液样和淀粉样变性。肿瘤细胞异型性小，通常呈圆形或卵圆形，具有上皮样或组织细胞样形态，胞浆丰富嗜酸性或嗜双色性，细胞内空泡常见，有时呈印戒样，这提示形成单细胞血管的趋势，这种单细胞原始管腔是血管内皮细胞瘤的特征（称细胞内原始血管腔）［5］。核内的胞浆包涵体常见。核分裂象少见。特殊染色：PEH瘤细胞AB/PAS染色陰性。免疫组化染色结果：PEH瘤细胞CD34、CD31及FⅧ、vimentin阳性，TTF－1、CK(pan),EMA阴性，25%-30%的病例灶性表达CK或EMA。电镜检查显示围绕肿瘤细胞的外板或基底膜，偶见紧密连接。细胞浆内腔隙是特征性的表现。最近发现PEH中存在一种非随机性染色体异常t(1;3)(p36.3;q25)［6］。

2.2 治疗：宜将肿瘤完整切除，并保证切缘干净，必要时辅以放疗和化疗。

2.3 鉴别诊断：肺上皮样血管内皮细胞瘤常常被误诊，X线或CT显示的结节不能定性，故只有病理学检查才可以确诊。PEH大体与组织学形态与肺脏腺癌类似（尤其在冷冻切片时），病理学检查时主要与以下疾病鉴别：1.腺癌：PEH瘤细胞呈巢状及索条状排列，而且细胞质内含有空泡，易被误诊为腺癌。但是腺癌癌细胞异型性明显，核分裂像易见，免疫组化表达上皮性标记，内皮性标记物均为阴性。可以与PEH鉴别。2.肺的转移癌：PEH瘤细可类似黏液腺癌。但若为黏液腺癌，特殊染色显示胞质内含有黏液，免疫组化血管内皮标记阴性可资鉴别。3.上皮样血管肉瘤：是血管肉瘤的亚型，肿瘤内含有不规则的血窦样腔隙，内衬的上皮样内皮细胞异型明显，并可见较多的核分裂像。多数病例可见坏死。而PEH瘤细胞异型性不明显，核分裂象和出血、坏死较少或不明显，是低度恶性肿瘤。4.上皮样肉瘤：多发生于远端肢体，由呈地图状的多结节组成，结节的中心为坏死物质，其周围瘤细胞常与邻近的梭形细胞及胶原组织在形态上有移行。而PEH瘤细胞形成原始血管，内见红细胞。间质黏液样，可有钙化、骨化、凝固性坏死，免疫组化表达内皮性标记物，可与上皮样肉瘤鉴别。

此外，PEH罕见，临床症状缺乏特异性，故极易被漏诊、误诊。PEH死亡率约为65%，一旦确诊，应及时采取有效的治疗措施，尽可能延长患者的生命。

参考文献

［1］Bagan P,Hassan M,Le Pimpec Barthes F,et al.Prognostic factors and surgical indications of pulmonary epithelioid hemangioendothelioma:a review of the literature.Ann Thorac Surg,2006,82(6):2010

［2］戴林，郑红芳，宋秋静.肺上皮样血管内皮瘤的临床病理观察.诊断病理学杂志，2008,15(4):294

［3］Dail DH,Liebow AA,Intravascular bronchioloalveolar tumor［J］.Am J Pathol,1975,78:6a-7a.

［4］Chen TM,Donington J,Mak G,et al.Recurrence of pulmonary intravascular bronchoaleolar tumor with mediastonal metastasis 20 years later［j］.Respir Med,2006,100(2):367-370.

［5］Fletcher C D M,Unni K K,Mertens F,蓍.世界卫生组织肿瘤分类及诊断标准系列.软组织与骨组织与骨肿瘤病理学和遗传学.程红，等译.北京:人民卫生出版社，2006：199

血管内皮祖细胞与血管新生 第3篇

1 EPCs概述

EPCs是血管内皮细胞的前体细胞,即能分化为成熟的血管内皮细胞的祖细胞。造血干细胞与EPCs来源于共同的干细胞——血液血管干细胞(hemangioblast),它们具有多种相同的抗原表达。1997年,美国波士顿伊丽莎白医学中心的Isner教授与其同事用磁式细胞分选法首次从人的外周血中分离出CD34+的单核细胞(MNCCD34+),体外培养发现MNCCD34+能分化成贴壁细胞ATCD34+,且发现ATCD34+具有内皮细胞家族的特性,能表达内皮细胞的表面标志物,并能摄取DiI标记的乙酰化的低密度脂蛋白(DiI-acLDL),从而证明了MNCCD34+即为假定的EPCs[1]。

EPCs存在于各种成年动物和人的骨髓和外周血中,主要存在于骨髓。在某些生理、病理状态下,EPCs可从骨髓释放,并在外周血中运行。近几年,人们从脐带血中分离出EPCs,并成功地诱导其分化为血管内皮细胞。不同培养时间的内皮祖细胞可能呈椭圆形、长梭形或纺锤形,在形态上无法与其他细胞区分开来,主要靠细胞表面标志来识别。目前将CD34、CD133(即AC133)、血管内皮生长因子受体1(Flk-1)、c-Kit、Sca-1、DiI-acLDL、血管性假性血友病因子(vWF)和血管内皮生长因子受体(VEGFR)-2等作为EPCs主要的细胞表面标志。正常情况下,EPCs的数量极少,在含有VEGF、成纤维细胞生长因子(FGF)等适合EPCs生长的培养条件下,可大量增殖扩增。新近报道,成体血管壁上有EPCs存在的特定区域,该区域的EPCs能分化为成熟血管内皮细胞,可作为出生后新血管发生的一个来源[2]。但由于缺乏确切的细胞表面标记和稳定的分离纯化技术,人体内哪些部位存在EPCs,有待进一步研究。

2 EPCs在血管新生中的作用

血管新生(angiogenesis)是指从已存在的微血管床上芽生出新的以毛细血管为主的血管系统的过程。自从Folkman提出血管新生的概念后,这个领域已成为一个新的研究热点[3]。传统观点认为血管新生包括两个概念:胚胎期的血管发生(vasculogenesis,VG)和出生后的血管生成(angiogenesis,AG)。Asahara等[1]用鼠和兔的肢体缺血模型证实EPCs参与了AG,给单侧肢体缺血的裸鼠从尾静脉注射来自人脐静脉血的EPCs(用DiI标记),组织学检查显示几乎所有标记的细胞都融入了毛细血管壁中。同时,他们用从兔外周血分离出的EPCs对单侧肢体缺血的新西兰家兔模型进行了自体回输实验,得出了类似的结果。

研究表明,成人中EPCs定居于骨髓,它可以被细胞因子或者来自于外周血中的血管生长因子信号动员到外周循环而进入外周血管组织中,通过整合进血管壁或提供生长因子两种方式来促使新生血管的形成。Shi等[4]从人骨髓中分离出了EPCs,并进行了犬的同种异体骨髓细胞移植术。移植术后6个月,又将涤纶做的血管假体置入犬的降胸主动脉,以防止周围组织的毛细血管延伸过来。12周以后,发现血管假体内壁有一层CD34阳性的内皮细胞,DNA分析显示这些细胞都来源于供体犬。这一结果能有效地说明骨髓来源的EPCs在体内能促进血管内皮的形成。Asahara等[5]复制表达β-半乳糖苷酶的转基因小鼠模型,并将其骨髓分别移植给免疫缺陷小鼠的心肌梗死和肿瘤模型,发现在梗死灶周围及肿瘤血管形成部位均有β-半乳糖苷酶阳性的细胞。结果表明,骨髓来源的内皮前体细胞能够迁移到血管形成活跃的组织,参与病理和生理性血管形成。

1998年,Hatzopoulos等[6]从鼠胚胎中分离出EPCs,还将鼠胚胎EPCs注射到鸡胚内,结果显示鼠EPCs参与形成了宿主的心内膜和脑微血管系统。Kawamoto等[7]在心肌梗死动物模型局部注射体外扩增的EPCs后,发现缺血局部血流增加、心功能改善、瘢痕面积缩小。Murohara等[8]从人的脐静脉血中成功地分离出了EPCs,同样显示EPCs参与形成内皮网。他们还将人的EPCs体外扩增后回输至肢体缺血的裸鼠模型体内,发现EPCs参与了缺血局部组织的新生毛细血管形成。Lyden等[9]在肿瘤动物模型发现,应用对VEGF敏感EPCs的抑制剂能减少局部血管生成和肿瘤生长。用磁共振(MRI)和共聚焦显微镜结合免疫组化染色观察,充分证实了EPCs参与肿瘤血管的新生[10]。

3 EPCs与治疗性血管新生

随着对血管形成机制研究的深入,Isner等[11]提出了“治疗性血管新生”概念,治疗性血管新生(therapeutic angiogenesis)是指将外源性血管新生诱导因子转入组织中增强缺血区域的侧支毛细血管新生。常用的生长因子有VEGF、bFGF等,但是这些生长因子的作用往往受到原有血管和血管内皮细胞(endothdial cells,EC)功能的影响。近年来EPCs参与的血管新生为缺血性疾病治疗提供了新思路, EPCs促进新生血管形成的机制是通过自身的分化、增殖而形成新生血管,无需依赖原有的血管系统。目前,有关EPCs与治疗性血管新生的研究主要处于从实验研究向临床治疗过渡的阶段,具体从内源性EPCs的动员及活化、骨髓单个核细胞移植、EPCs的基因修饰三方面展开。

3.1 内源性EPCs的动员及活化

成人EPCs主要存在于骨髓,在某种病理状态下骨髓中的EPCs可经动员进入外周循环。某些细胞因子、趋化因子在EPCs的动员中发挥重要作用。在机体局部缺血组织中,内源性的VEGF及基质细胞衍生因子-1(SDF-1)对EPCs的动员有重要作用。无论是在动物实验还是临床试验,通过质粒或重组蛋白质增加循环VEGF水平以提高外周血中EPCs都取得了预期的效果[12,13]。由腺病毒介导的基因引入致SDF-1或血管生成素-1过表达亦能提高大鼠的EPCs水平[13,14]。其他一些能动员EPCs和造血祖细胞的细胞因子有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF),后者已应用于临床骨髓移植患者多年。最近有研究表明在动物模型体内促红细胞生成素(Epo)显著增强EPCs的动员[15] ,Epo能刺激CD34+/CD45+的EPCs动员进入人体外周血。其他的细胞因子如IL-3、IL-8、IL-11、干细胞因子(SCF)及巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)亦可动员EPCs,但作用较弱。除细胞因子外,几种药物也已被证明可增加EPCs的数量,其中他汀类药物的研究报道较多,研究证实,他汀类药物可诱导EPCs从骨髓动员,阿伐他汀可增加脾源性EPCs[16],罗苏伐他汀可提高循环内Sca-1+/Flk-1+的EPCs。此外,一些降糖药物、雌二醇、中药葛根素及银杏叶提取物等均有加速EPCs动员及增殖的作用[17,18]。促进内源性EPCs的动员和活化,使EPCs的数量更易满足治疗性血管新生的要求是血管新生治疗在方法学上的一个新思路。利用这些动员剂或研制开发一些具有临床应用价值的药物,有望实现真正意义上的“无创”治疗。

3.2 骨髓单个核细胞移植

骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BM-MNC)移植是由EPCs移植衍生出的一种血管新生治疗新方法。成年个体的BM-MNC中含有多种干细胞成分,其中EPC含量约占BM-MNC总数的3%,为外周血的15倍,同时BM-MNC移植还可以提供多种促血管生长因子,故BM-MNC移植兼具EPCs和细胞生长因子的作用。

Kalka等[19]将人的EPCs移植给无胸腺裸鼠的缺血下肢后,缺血下肢的毛细血管密度和血流恢复明显增加,肢体丢失较对照组明显减少。Shintani等[20]将兔的自体骨髓单个核细胞注入缺血下肢的腓肠肌,发现移植的骨髓单个核细胞存在于骨骼肌的新生内皮细胞毛细血管网,毛细血管密度较对照组增加。Al-khaldi等[21]将小鼠自体骨髓干细胞移植到左髂总动脉结扎后缺血肢体的大腿前内侧肌室的肌肉中,发现其分化为内皮细胞、血管平滑肌细胞、骨骼肌细胞和脂肪细胞,缺血后肢移植细胞处的毛细血管密度、小动脉密度、股动脉血流指数较对照组增高。Padilla等[22]在雄性大鼠下肢缺血模型中证实骨髓来源的EPCs移植是诱导血管新生的一种安全可行的方法。Kamihata等[23]在猪急性心肌梗死模型中发现,BM-MNC移植3周之后梗死部位的血流量和毛细血管密度分别增加4.6倍和2.8倍,左室射血分数提高48%,冠脉造影可见侧支血管数目增加5.7倍。Hamano等[24]在犬慢性心肌缺血模型中采用BM-MNC心肌注射,30 d后发现缺血心肌的微血管生成明显增多,心室壁增厚,室壁运动明显改善。

除动物实验外,在一些前瞻性的临床试验中BM-MNC移植亦取得了较好的效果。Tateishi-Yuyama等[25]首次报道了骨髓干细胞移植治疗周围血管病患者的临床报道。 Saigawa等[26]应用骨髓细胞移植治疗8例动脉硬化闭塞患者,都取得了较好的临床疗效,并且揭示了移植CD34+细胞数量多少反映了临床疗效的改善程度。Hamano等[27]报道5例严重冠心病病人于冠脉搭桥术中在无法进行桥血管移植的区域行BM-MNC心肌注射,术后1个月随访时,有3例注射区域的心肌灌注扫描结果明显改善。Aesmus等[28]报道了用经冠脉内移植骨髓来源或外周血来源体外培养扩增的EPCs治疗20例、28例和59例急性心肌梗死患者随访4个月和1年的临床研究,即TOPCARE-AMI研究,结果表明,两种来源的EPCs疗效相似,均能显著增加冠脉血流储备,改善左室功能。

3.3 EPCs的基因修饰

最近有学者提出通过基因修饰来改变EPCs的生物学性状,从而增强其治疗活性。同单纯用生长因子治疗或单纯的细胞移植治疗相比,利用EPCs作为种子细胞的基因治疗配合干细胞治疗对血管新生的作用更加有效而显著。Iwaguro等[29]采用VEGF164基因的腺病毒载体转染EPCs,转染后的EPCs分泌VEGF量显著增加,效应持续时间超过4周,在此基础上,EPCs的增殖活性、黏附活性及促血管新生的能力明显增强。在大鼠下肢缺血模型中观察到,VEGF基因转染后的EPCs在治疗用量上较常规用量减少30倍,而治疗效能较对照组提高63.7%。该实验还证实了VEGF与EPCs在血管新生治疗上的协同性,为今后缺血性心脏病的血管新生治疗研究指出了一个新的发展方向。Ikeda等[30]移植转染了人VEGF的脐血来源的EPCs到慢性下肢缺血的大鼠模型体内,结果显示转染组的下肢血流比未转染的对照组显著增加。Murasawa等[31]将人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因通过腺病毒载体转导人EPCs,增加其端粒酶的表达,从而使EPCs的再生能力得以恢复(或提高),抗凋亡活性增强,生命周期延长;同时发现,EPCs在增殖活性、迁移活性、分化能力等方面也显著增强,离体及在体促血管新生的能力亦有明显提高。姜萌等[32]在人外周血EPCs中导入人低氧诱导因子(HIF-1α)基因,研究显示在体外HIF-1α转染后的EPCs扩增及迁移功能改善,在体内可促进缺血下肢的局部血管新生。

4 结 语

视网膜血管内皮细胞 第4篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

(1) 药品:葛根素注射液 (郑州羚锐制药股份有限公司) ;噻唑蓝 (MTT) , 以PBS溶解成5 mg/ml备用。 (2) 免疫细胞化学试剂:一抗, 鼠抗人细胞内皮生长因子 (VEGF) 单克隆抗体, 4℃保存;二抗, 单克隆羊抗鼠;ECL显色液;人脐静脉内皮细胞 (HUVECs, 北京裕恒丰科技有限公司) 。

1.2 方法

(1) 细胞培养:将HUVECs在含有10%胎牛血清、青霉素100U/ml及链霉素100U/ml的DMEM培养基中, 以0.25%胰酶消化, 在37℃、5%CO2条件下培养, 每周换液传代3次。取生长良好的HUVECs (调整细胞浓度为2×105/ml) 接种于96孔培养板, 每孔200μl, 设3个平行孔;用葡萄糖、葛根素及葛根素联合葡萄糖作用HUVECs 24h。 (2) 分组:根据以上实验方法, 分为正常组 (5.5mmol/L) 、高糖组 (35mmol/L) 、葛根素组 (200 mg/L) 、联合组 (葛根素联合高糖35 mmol/L) 及用DMEM培养基和二甲基亚砜 (各2μl) 培养的细胞为对照组。在Genebank检索基因cDNA序列, 自行设计PCR引物, 由上海生物工程公司合成。

1.3 检测指标

(1) 细胞增殖情况:倒置显微镜下观察细胞生长情况;MTT检测细胞增殖情况, 细胞增殖率= (实验组平衡A值-对照组平衡A值) /对照组平衡A值×100%, 计算细胞A值及标准率。 (2) VEGF mRNA表达;用RT-PCR检测。 (3) VEGF蛋白表达:采用蛋白质免疫印迹实验法进行, X线曝光显影, 软件扫描定量, 每个浓度组重复3次, 取均值。

2 结果

高糖为35 mmol/L时, 其A值与对照组比较明显下降 (P<0.05) , 葛根素组于葛根素200 mg/L时其A值与对照组比较明显升高 (P<0.05) , 联合组与对照组比较, 葛根素联合高糖时对细胞则出现明显的增殖作用 (P<0.05, 表1) 。作用HUVECs 24 h VEGF mRNA表达A值为, 对照组 (0.704±0.03) , 高糖组在35mmol/L时 (0.45±0.02) , 联合组在葛根素200 mg/L联合高糖35mmol/L时 (0.59±0.01) ;其VEGF mRNA吸光度A值, 高糖组与对照组比较明显下降 (P<0.05) , 联合组与对联合组与对照组比较差异无显著性意义。作用HUVECs 24h VEGF蛋白的表达为, 与对照组比较, 高糖组35mmol/L时VEGF蛋白表达下调 (P<0.05) 。葛根素组 (200mg/L) 及联合组 (葛根素200 mg/L、高糖35 mmol/L) 相近。

3 讨论

糖尿病是心肌梗塞的危险因素之一, 本文研究结果表明:高糖作用人体HUVECs有明显抑制作用[2]。高糖和葛根素同时作用HU-VECs后, 则能修复高糖对细胞的损伤。高糖抑制血管增殖可能与血管内皮细胞的凋亡有密切关系[1,2], 加剧血管病变的发生。VEGF与受体结合, 激活酪氨酸蛋白激酶, 从而催化自身及底物蛋白质的酪氨酸残基磷酸化、使信息传递并发生生物效应。还有资料表明血管损伤后VEGF使新内膜显著增厚。葛根素是含有多种药理活性的物质及营养元素, 能抑制血小板聚集, 降低血浆纤维蛋白原浓度, 增加细胞表面电荷而降低血粘度。对抗血栓素A2 (TXA2) 样物质的生物活性, 增加PGI2的活性, 使血栓形成时间延长, 血栓长度及重量减少, 凝血酶原时间延长, 优球蛋白溶解时间缩短, 还可拮抗内皮素, 直接降低血管外周阻力, 增加器官血流量。

本文结果表明, 高糖能使血管内皮细胞VEGF mRNA和蛋白表达下调;而葛根素和高糖同时作用能抑制其下调。虽然葛根素不能使VEGF mRNA和蛋白表达明显上调, 但能使其表达正常, 从而保护高浓度高糖对血管内皮的损伤, 这可能是葛根素治疗糖尿病并发组织缺血性疾病的机制之一。

参考文献

[1]娄金荣.胰岛素抵抗与内皮功能障碍[J].心血管病学进展, 2005, 26:117-119.

视网膜血管内皮细胞 第5篇

1 血管内皮细胞凋亡与动脉粥样硬化

血管内皮细胞位于血流与血管平滑肌之间, 不仅是一道生理屏障, 更重要的是其有高度的代谢活性, 可分泌合成多种血管活性物质。这些活性物质对血管张力, 血细胞与血管内皮的粘附性, 血液流动性, 血管平滑肌的增生均有调节作用。动脉粥样硬化是导致临床心脑血管疾病的重要原因。一般认为动脉粥样硬化始于血管内皮细胞损伤后, 脂质沉着明显增加, 促进细胞粘附、迁移和平滑肌细胞增殖, 伴随血浆凝血纤溶机制受损, 生长因子增多等一系列反应。正如Schwarts 近年指出"动脉粥样硬化的发生是多层次的, 是各种因素和细胞成分间相互影响的瀑布式的发展过程".现已证明, 细胞凋亡在动脉血管壁的硬化过程中起到很重要的作用。TUNEL 染色显示, 人自身冠状动脉和隐静脉血管移植所致的粥样硬化标本中, 有广泛的细胞凋亡 (在富含脂肪粒的粥样化瘤中有高达34 %的细胞) .在动物模型和人体的动脉粥样硬化病变中已发现凋亡的内皮细胞, 而且几乎所有已知的致粥样硬化的危险因素都能在体外实验中引起内皮凋亡或增加体内循环内皮细胞的数量[2], 最近研究证明, 血管内皮细胞的过度凋亡一方面增强组织因子的活性, 加强血小板聚集能力, 促进血液凝固, 另一方面促进动脉粥样硬化斑块的糜烂, 继发血栓形成[3]。众多研究表明, 血管内皮细胞的凋亡与动脉粥样硬化的发生发展有着密切的联系。

2 动脉粥样硬化中内皮细胞凋亡诱导因素

2.1 氧化型低密度脂蛋白 内皮细胞的许多生理和病理过程都与脂蛋白密不可分, 其中oxLDL的作用最为突出。大量实验证实, 易发生动脉粥样硬化的局部血管的内皮细胞具有更新增加的现象, 说明内皮细胞更新和此前的细胞凋亡与动脉粥样硬化斑块形成有关。凋亡加速使内皮细胞更新增加.从而改变内皮细胞功能, 诱发动脉粥样硬化发生。血管内皮细胞的凋亡可能是动脉粥样硬化形成的始发骤[4]oxLDL作为动脉粥样硬化的关键物质, 能诱导体外培养的内皮细胞发生凋亡, 作用具有剂量依赖性和时间依赖性[5,6,7,8,9]。许多研究显示oxLDL在动脉粥样硬化形成早期起重要作用。体外研究已经证明oxLDL对培养的内皮细胞有细胞毒性。胆固醇氧化物使培养的牛主动脉内皮细胞凋亡增加, oxLDL使人脐静脉内皮细胞凋亡增加. 毒性剂量的oxLDL能诱发培养的内皮细胞出现大批凋亡. 有学者认为ox-LDL能促使细胞色素C从线粒体中释放到细胞质中, 损坏了线粒体膜, 进而诱导内皮细胞发生凋亡。

2.2 过氧化氢 体外实验显示, 高浓度过氧化氢可引起细胞坏死, 低浓度过氧化氢则引起内皮细胞凋亡.存活的细胞出现分化抑制, 提示低浓度的过氧化氢引起内皮细胞凋亡对血管壁的损伤比高浓度的过氧化氢引起内皮细胞坏死更为重要.因为覆盖在血管壁的凋亡细胞影响血管内皮依赖性舒张功能以及血管内皮细胞再生, 有利于动脉粥样硬化的发生[10]。2.3 活性氧 活性氧 (ROS) 能诱导各种类型的细胞发生凋亡。在血管壁, ROS由动脉粥样化斑块处巨噬细胞形成, 在单核细胞、白细胞粘附后作用于内皮。内源性的ROS由内皮与血管平滑肌NADPH氧化酶合成, AngI、OX-LDL、肿瘤坏死因子 (TNF-α) 均可诱导其合成。内源性的ROS可以影响内皮细胞线粒体膜通透性, 促使细胞色素C释放, 从而诱导内皮细胞凋亡。

2.4 细胞因子 一些细胞因子是体内常见的凋亡诱导剂, 已有实验表明在动脉粥样硬化形成发展过程中, 内皮细胞分泌TNF-α增加, 而TNF-α又具有抑制内皮细胞增殖, 促进凋亡、增加白细胞黏附、诱导细胞黏附分子一l表达等作用, 因此TNF一α被认为是动脉粥样硬化发生发展的重要因素之一l4 J。大量资料表明抗氧化剂有预防动脉粥样硬化作用, 研究发现抗氧化剂对血管内皮细胞有一定的保护作用, 并一定程度地抑制由TNF一α诱导的血管内皮细胞凋亡[11], IFN-γ体外能够上调血管内皮细胞TNF-α的表达, 并且诱导内皮细胞凋亡, 这表明IFN-γ可能与动脉硬化斑的形成及发生、发展成正相关。可能的机制是通过上调内皮细胞C表达TNF-α, 而TNF-α促进内皮细胞的凋亡, 内皮细胞位于动脉硬化斑的表面。具有稳定硬化斑的作用。而内皮细胞凋亡导致血管内壁的损伤.其结果是局部血凝块的形成、刺激内皮细胞的增生及炎性细胞的浸润, 最终促进了动脉硬化斑的形成及发生、发展[12]。此外, 基础研究显示AngII诱导内皮细胞凋亡[13]。

3 动脉粥样硬化中血管内皮细胞凋亡相关基因

目前在哺乳动物中, 已发现许多基因与内皮细胞凋亡相关, 明确证实参与凋亡调控的基因有p53, Fasc-myc和bcl-2等, 另发现10余种基因在细胞凋亡过程中有表达。细胞凋亡并不只是线性通路, 而更可能存在凋亡信号分子相互影响的环性通路。尤其是Caspases、线粒体膜Bcl-2家族以及CYC间存在的相互作用, 似的上游分子和下游分子的凋亡信号可以呈环级联放大, .介导凋亡表征出现的主要是能自身激活放大的Caspases蛋白酶家族[14]。而Caspases可能存在细胞外和细胞内两条激活途径:细胞外途径, 即细胞外受体, 主要有Fas TNF家族和TGF-β等, 与各自的配体相互结合后激活下游的信号转导, 细胞外受体存在于心血管组织, 细胞外受体的表达可以受许多病理因素的影响.另一方面在外界病理因素作用下, 心血管组织本身也产生细胞外配体如TNF-α, 这些自身产生或来自其他源的细胞外配体与心血管组织的的细胞外受体结合, 可引起心血管内皮细胞的凋亡[15]。细胞内途径, 除了来自细胞外的信号, 细胞内部的变化也是凋亡发生的重要因素, 这方面尤以线粒体病变最引人注目.凋亡启动后, Bcl相关x蛋白 (Bax) 由胞液转移至线粒体膜上, 在此构建膜孔或裂隙.上述基因对细胞凋亡的作用十分复杂, 在具有不用作用的基因之间存在着复杂的相互制约或相互促进作用[16]。

4 展望

视网膜血管内皮细胞 第6篇

1 材料与方法

1.1 材料

Wistar大鼠，雄性，200g左右，扬州大学比较医学中心提供。人重组VEGF165，美国Prospec公司;HG-DMEM和胎牛血清 (FBS) ，美国Gibco公司;兔抗大鼠CD31抗体，美国Santa Cruz公司;羊抗兔FITC荧光抗体，瑞士Roche公司;Matrigel基质胶，美国BD公司;Trypsin、Pen/Strep/Amphotericin B、戊巴比妥钠、肝素钠，生物工程 (上海) 有限公司;羊抗兔即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、Mayor, s苏木素均为武汉博士德生物工程有限公司产品;EDTA、氯化钠、氯化钾和磷酸二氢钾，天津科密欧化学试剂有限公司;多聚甲醛、甲醇、硫酸铜、碳酸氢钠和Na2HPO4·12H2O，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠胸主动脉血管内皮细胞的分离与原代培养

Wistar大鼠2%戊巴比妥钠麻醉后，经75%乙醇浸泡消毒后固定在手术板上，在超净工作台中打开胸腹腔，分离胸主动脉。取出胸主动脉，用PBS冲洗3～4次后，放入另一个无菌培养皿中，用眼科镊小心除去血管周围结缔组织及脂肪，纵行剖开血管，用眼科剪分割成2mm×2mm大小的血管块，将血管块内皮面向下贴于铺有明胶的50ml培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中静置2h后，加入适量含20%FBS、4ng/mlVEGF165和100μg/ml肝素的DMEM培养液培养[2,3,4]，液体仅遮盖主动脉即可。培养4d后，弃去主动脉植块，2～3d换液1次。

1.2.2 传代培养

原代细胞培养约12～14d，迁出生长的细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上时即可传代[3]。弃去培养液，用PBS冲洗培养瓶后，加0.25%胰蛋白酶消化3～5min，见内皮细胞收缩变圆，立即加入等体积的含胎牛血清的DMEM培养液终止消化，吸管轻轻吹打并混匀，移入10ml离心管中，1000r/min离心10min，弃上清，加入含10%FBS的DMEM培养液适量制成细胞悬液，分至2个50ml培养瓶中。根据内皮细胞贴壁时间快于成纤维细胞，因此传代4h后换液以除去未贴壁杂细胞，以后隔天换液1次。

1.3 细胞鉴定

1.3.1 细胞形态

倒置显微镜下观察不同代次的细胞形态，是否呈现内皮细胞典型的折光性强、“铺路石”样等特点[3,5]。

1.3.2 CD31免疫细胞分析

取2代细胞，制成细胞悬液后分于放有盖玻片的六孔板中，进行细胞爬片培养。待细胞融合至80%左右取出盖玻片，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定30min, PBS清洗后滴加0.5%Triton-X10010min;PBS清洗后加3%H2O220min, PBS再次清洗后加5%BSA封闭30min。滴加兔抗鼠CD31一抗4℃过夜，PBS代替一抗作阴性对照。第2天经PBS清洗后分别滴加羊抗兔二抗及羊抗兔FITC荧光二抗，进行DAB显色和荧光细胞分析。

1.3.3 内皮细胞的管形成

96孔板中先加入50μl基质胶于37℃培养箱中30min，后每孔加入1×104个第2代细胞悬液100μl，使细胞在基质胶表面均匀散开，置37℃、5%CO2培养箱中，培养2h后观察细胞形成的管状结构。

1.4 内皮细胞生长曲线

原代细胞及传代培养的细胞，调节细胞密度至2×105个/ml。24孔板每孔中加入细胞悬液100μl，含20%FBS的DMEM培养基900μl，于37℃、5%CO2培养。第2天开始，每天4孔连续计数6d，分别绘制2～6代细胞的生长曲线。

2 结果

2.1 内皮细胞分离及形态

主动脉块培养4d时，可见动脉块附近有原代内皮细胞迁出生长，细胞呈梭状或多角。培养12～14d，迁出生长的细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上，可见血管内皮细胞的“铺路石”样特征，见图1。

A：培养至第4天时，血管旁有内皮细胞迁出生长;B：培养至第12天时，内皮细胞融合生长呈‘铺路石“样。

2.2 CD31免疫细胞分析

CD31抗体免疫细胞化学(1) SABC显色，可见胞浆中淡黄棕色阳性细胞[6];(2) FITC荧光二抗分析，可见胞浆中绿色荧光强阳性细胞，见图2。

A:SABC/DAB显色;B:FITC荧光

2.3 内皮细胞管形成

从大鼠胸主动脉分离的原代内皮细胞及传代培养细胞，在Matrigel基质胶中培养2h后，均可见形成部分管状结构;至培养6h可见形成完整的血管样小管。

2.4 内皮细胞传代培养生长曲线

大鼠胸主动脉血管内皮细胞进行了六代传代培养，不同代次细胞形态上无变化，细胞生长曲线见图4。细胞于分瓶后4天至对数生长期，在相同培养时间不同代次细胞数无明显差异 (P>0.05)。

A：培养2h时可见部分管形成;B：培养6h时可见形成完整的管

3 讨论

内皮细胞的获取方法主要包括机械刮取法、酶消化法和植块法[7]。大鼠主动脉管腔较细酶消化法操作难度较大，获取内皮细胞数量较少，而机械刮取法获得的内皮细胞掺杂较多的杂细胞，本研究采用植块法获取的内皮细胞数量多，通过培养基中添加VEGF细胞因子、肝素等物质可以促进内皮细胞生长为优势细胞，从而保证了内皮细胞的纯度;而传代过程中采用的差速消化法，内皮细胞脱壁时间早于成纤维细胞，在内皮细胞脱壁时成纤维细胞仍处于贴壁状态，可以进一步除去杂细胞，获得纯度较高的内皮细胞。

血管内皮细胞的标记物有第Ⅷ因子、CD31、v WF、CD34、VEGFR和Weibel-Palade小体等[8,9,10]。CD31作为成熟内皮细胞表面分子标志物之一，近年来较多的被用于内皮细胞的的鉴定。本试验采用CD31免疫SABC组化及免疫荧光抗体分析对内皮细胞进行鉴定，内皮细胞阳性率较高，管形成试验也进一步验证了分离培养的内皮细胞的特性。

参考文献

[1]黄丽英.血管内皮细胞的原代培养及CXCL16对其影响的研究[D].云南昆明:昆明医学院, 2003.

[2]迟晓艳, 徐金青, 高文武.兔主动脉血管内皮细胞的分离与体外培养[J].鲁东大学学报 (自然科学版) , 2011, 27 (1) :55-57.

[3]杨翠燕, 王金凤, 张艳萍等.大鼠胸主动脉血管内皮细胞的分离培养和纯化鉴定[J].解放军医学杂志, 2010, 35 (2) :195-196.

[4]Mika K, Kenji I, Eiji W, Et al.A simple method of isolating mouse aortic endothelial cells[J]Journal of Atherosclerosis and Thrombosis, 2004, 12 (3) :138-142.

[5]姜文.大鼠肺微血管内皮细胞原代培养方法研究[J].中外医学研究, 2011, 9 (10) :3-4.

[6]Cynthia AF and Charles WP.Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells[J].In Vitro Cell Dev Biol~Animal, 2002, 38:208-212.

[7]陈瑞华, 赵自刚, 牛春雨等.大鼠肺微血管内皮细胞的培养[J].实验研究, 2007, 11 (1) :16-18.

[8]Pisacane AM, Picciotto F, Risio M.CD31and CD34expression as immunohistochemical markers of endothelial transdifferentiation in human cutaneous melanoma[J].Cell Oncol, 2007, 29 (1) :59-66.

[9]高航, 关春艳.兔主动脉内皮细胞培养及鉴定:内皮细胞分离方式及培养条件的改良[J].中国组织工程研究与临床康复, 2010, 14 (11) :1919-1922.

视网膜血管内皮细胞 第7篇

1997年首次报道血管内皮前体细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)的存在及其再生血管的能力[1],过去十年来的研究基本证实EPCs是一群具有游走特征,能进一步分化的幼稚内皮细胞。CD34和VEGFR2被认为是鼠EPCs表面的重要分子标记[2]。近年来随着EPCs的发现和逐步深入的研究,EPCs在血管内皮损伤、修复及新生血管形成中的作用日益受到关注,成为当前新的研究热点[3,4,5]。

血管内皮损伤导致的高渗水肿和缺血低氧促使大量异常新生血管形成是临床上增殖性糖尿病视网膜病变主要病理表现。但是EPCs参与视网膜新生血管形成的机制并不清楚,而且视网膜血管病变的病理研究当前仅局限在各种原因所致的血管内皮损伤,促使一些血管生成因子的释放,加重了组织水肿及缺血缺氧,对于血管细胞与其他细胞之间的相互作用和信号传导调控机制并不清楚,忽视了视网膜组织存在大量神经元及胶质细胞、而神经组织也许在视网膜血管组织病变的病理发展过程于中有重要介导作用的可能[6,7]。本研究将神经胶质细胞与EPCs在有孔的双层培养系统中共培养,检测神经胶质细胞对EPCs移行的影响,并检测相关细胞因子的表达,旨在阐明神经胶质细胞介导EPCs移行参与新生血管形成的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

培养液:Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM,Introvigen);荧光抗体及其他:FITC-CD34,PE-VEGFR2;阴性及阳性对照磁珠;Fc R受体封闭液CD16/32(BD-Pharmingen USA);Propidium iodide(Molecular Probe,Oregon,USA);血管内皮细胞生长因子(vasular endothelial growth factor,VEGF)及基质细胞衍生因子(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)细胞因子检测试剂盒(R&D,mouse Quantikine ELISA Kit);缓冲液HBSS、PBS及红细胞裂解液(Gibco)。

1.2 鼠骨髓内皮前体细胞(EPCs)分离,分选及收集

参引文献[8]报道的方法,取小鼠双下肢胫骨与腓骨,用21号针头以缓冲液HBSS冲洗骨髓,过滤,离心,裂解红细胞,取单核细胞,制备细胞悬液于含3%胎牛血清的HBSS缓冲液。在室温下给予Fc R受体封闭液CD16/32封闭20 min后加入已被荧光标记的抗体PECY7-CD34HIPE-VEGFR2,避光4℃孵育20 min,PBS清洗,离心细胞重悬在3%HBSS中,细胞密度调整为107/m L待用。同时用阴性及阳性磁珠(BD-Pharmingen)准备阴性及阳性对照标本并用非荧光标记的细胞样品作为纯细胞样品,上述对照样品用于荧光图谱的参数设置及荧光补偿调整。将标记的细胞通过FACS VantageTM(Becton Dickinson)流式细胞仪检测分选。CD34和VEGFR2双重标记均阳性的细胞为EPCs富含细胞群。死细胞经碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色,排除在外。细胞收集后离心重悬于DMEM培养液内,细胞计数,调整细胞浓度,待用。

1.3 视网膜神经胶质细胞对EPCs移行的作用

参考文献[9]报道的方法无菌条件下在12孔Transwell(Costar)双层共培养系统的下层培养皿内种植神经胶质细胞(原代分离获取)或对照组成纤维细胞,按104/孔接种细胞。骨髓EPCs种植于共培养系统的上层有孔(8μm孔)培养皿,无血清DMEM培养液,共培养24 h后在200倍显微镜下,计数存留在上层培养皿有孔膜上的细胞数,从而得出EPCs通过孔隙的迁移数量。每孔培养皿随机取5处,记录平均值。

1.4 ELISA检测视网膜神经胶质细胞培养下VEGF因子及SDF1因子的含量

收集共培养系统的细胞培养液,经过过滤,每样品200μL待用。实验过程严格按实验说明书对细胞培养液中细胞因子的检测方法进行(VEGF Quantikine ELISA Kit,SDF-1 ELISA Kit R&D Systems),完成样品处理后,酶标仪读数在450 nm光谱测量光吸收值(opacity density,OD),参照光谱为540 nm。OD值经试剂盒内内参照换算成细胞因子浓度。实验组及对照组分别各有10个样品,每个样品在酶标仪器上测试两次,实验结果取平均值.

1.5 统计分析

数据用均值±标准差表示,应用SPSS10.0统计分析软件包对数据进行成对t检验,P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 骨髓血管内皮前体细胞(EPCs)分选

小鼠骨髓经裂解红细胞和离心后取单核细胞层,再经荧光激活流式细胞仪分选获取CD34+VEG-FR2+的EPCs细胞。如图1A所示P1为小鼠骨髓外周血单核细胞分布图,图1B-P2为PI染色阴性的活细胞,PI染色阳性的死细胞排除在外;图1C右上象限P3所示的CD34+VEGFR2+双标阳性细胞群为小鼠骨髓富含EPCs的细胞群,即本实验所用的骨髓EPCs细胞,约占全部细胞的0.025%。

2.2 EPCs细胞与神经胶质细胞共培养的细胞转移的检测及比较分析

在Transwell共培养系统中(图2),无血清DMEM培养液培养24 h后检测内皮前体细胞通过孔隙的迁移数量。本实验中以计数存留在上层培养皿的EPCs细胞数量来间接确定移动到下层的细胞的数量。存留在上层的细胞数量越少,表明细胞移动到下层的越多(图3A和B)。本实验中与神经胶质细胞共培养的实验组存留在上层的细胞数为(20±16)个,而对照组与成纤维细胞共培养组为(170±55)个,结果表明实验组EPCs从上层移动到下层的数量显著高于对照组(P<0.01)(图3C)。

2.3 ELISA检测视网膜神经胶质细胞共培养下VEGF因子及SDF-1的释放含量

与神经胶质细胞共培养24 h后,收集细胞培养液,进行酶联免疫吸附试验(ELISA),检测细胞释放到培养液内的VEGF和SDF-1表达,结果如图4所示,EPCs与神经胶质细胞共培养组的培养液中VEGF含量显著高于成纤维细胞组[(230.28±27.37)pg/m L vs(89.22±11.23)pg/m L,P<0.01],而在神经胶质细胞组的SDF-1含量也同样显著高于成纤维细胞组[(328.34±57.42)pg/m L vs(62.44±34.35)pg/m L,P<0.01)]。

3 讨论

随着对EPCs细胞研究的逐渐深入,EPCs在血管损伤修复及新生血管中的作用正受到关注[4,10]。糖尿病作为全身系统性疾病,其血管病变在不同组织器官的表现并不完全一致。由糖尿病引起的冠心病、周边动脉阻塞性疾病以及伤口愈合显著延迟患者的血管再生明显受限,而糖尿病视网膜血管损害促发的缺血低氧可诱发大量视网膜新生血管形成[11,12]。糖尿病患者EPCs的耗竭或功能衰竭的假说无法解释糖尿病视网膜病变中广泛的视网膜新生血管化,何种关键因素导致了糖尿病缺血性视网膜的大量新生血管形成以及EPCs如何被动员移行至视网膜参与这一过程,目前并不清楚。

血管再生、新生血管形成的反应涉及到3个方面:(1)损伤组织可以产生足够的信号发送到干细胞或前体细胞;(2)信号作用能够激活干细胞或前体细胞的反应;(3)干细胞或前体细胞能够顺利移行到达损伤组织区域。OTANI[13]的研究揭示,骨髓来源的干细胞(富含EPCs)能选择性靶向作用于视网膜内的胶质细胞,恢复视网膜血管萎缩变性新生鼠的血管生长。这一研究表明神经胶质细胞可能介入了EPCs参与视网膜血管发生的过程。因此笔者推测,视网膜内大量神经组织的存在可能是糖尿病病理状态下新生血管易形成的一个重要因素。本研究在细胞培养中通过细胞共培养,研究视网膜神经胶质细胞诱导EPCs移动的作用及相关细胞因子的表达,首次将视网膜胶质细胞介导的对EPCs移动的作用进行了研究。

本研究发现,CD34+VEGFR2+细胞占全部骨髓细胞的0.2%,而外周血循环中这一比例要远远低于骨髓中的比例。骨髓内的EPCs细胞如何移行到损伤组织区域是研究血管修复、新生血管形成的一个重要方面。笔者将一定数量的富含EPCs的细胞群与神经胶质细胞共培养后发现,与对照组成纤维细胞相比,神经胶质细胞显著促进了EPCs细胞群的移行。同时研究检测到,共培养系统的培养液中有VEGF和SDF-1表达,这些细胞因子可能与EPCs的移行相关。这一实验结果提供了直接的实验数据,即细胞共培养中神经胶质细胞可能通过细胞因子的分泌作用,导致EPCs的移行增强。从这一实验结果可以合理地推测,体内神经胶质细胞在病理状态下,可能通过增强某些细胞因子的释放,激活了相关信号通道,从而动员了骨髓中EPCs的移行。

VEGF是众所周知的强血管生长因子,能增强了血管渗透性和蛋白酶的活性,促进了内皮细胞的迁移和增殖,是新生血管形成的主要调控因子[14]。SDF-1近年来被确定促发了静止骨髓干细胞的活化和移行,而神经胶质细胞积极参与了这些细胞因子的释放[15,16]。本实验检测到与视网膜神经胶质细胞共培养系统的培养液中,VEGF及SDF-1因子都有表达,而在活体内病理状况下,VEGF及SDF-1的表达可能会更高,考虑到VEGF和SDF-1在血管再生和新生血管形成中的重要作用,笔者认为神经胶质细胞分泌的VEGF以及SDF-1都可能参与了EPCs的移行。这也提示神经胶质细胞确实以一定的方式参与了血管组织的病理生理活动。但是,神经胶质细胞对血管组织的作用可能非常复杂,释放神经因子和血管生长因子,激活干细胞移行只是其作用的一个方面,神经胶质细胞也可能直接干预EPCs的功能活性,如增殖、分化、组织定位修复等。VEGF和SDF-1以外的其他细胞因子的表达也都可能涉及到增强新生血管的反应,但这些因子是什么、如何对EPCs起作用,还需要进一步的认识和明确。这些都是非常重要的研究课题,都将使医学界对神经胶质细胞介入血管组织病理生理的作用有更全面的认识;而且神经胶质细胞在血管性病变的作用也可以解释糖尿病视网膜病变患者容易形成大量的新生血管的原因。

总之,本研究提供了直接的实验数据,证实在体外培养系统中,视网膜神经胶质细胞可通过细胞因子的分泌作用导致EPCs的移行增强,在EPCs参与的新生血管形成中可能有重要的介导作用;而这一作用可能涉及到神经胶质细胞能够分泌VEGF以及SDF-1因子,但这些因子的作用机制还需要进一步证实。本研究的意义在于,有可能提供新的治疗途径,通过干预神经胶质细胞的信号通道作用,而抑制视网膜新生血管的形成。另外,对神经组织和血管组织相互作用关系的研究也有助于加深对视网膜血管性病变的病理机制的认识。

摘要：目的 探讨视网膜神经胶质细胞对小鼠骨髓血管内皮前体细胞(EPCs)迁移的作用及可能机制。方法 荧光免疫激活流式细胞仪分选获得小鼠骨髓血管内皮前体细胞,分别用神经胶质细胞或对照组成纤维细胞作为条件共培养细胞与EPCs细胞共培养24h后,检测内皮前体细胞通过孔隙的迁移数量;并用ELISA法检测培养液内VEGF及SDF-1的含量。结果 CD34/VEGFR2双标阳性的细胞为富含骨髓血管内皮前体细胞的细胞群,约占全部骨髓细胞的0.2%;当EPCs神经胶质细胞共培养24h后,EPCs通过孔隙的数量显著高于对照组与成纤维细胞共培养时通过的数量(上层存留细胞(20±16)个v(s170±55)个,P<0.01)。与神经胶质细胞共培养系统细胞培养液中VEGF及SDF-1含量显著高于对照组[VEGF:(230.28±27.37)pg/mL vs(89.22±11.23)pg/mL,P<0.01;SDF-1:(328.34±57.42)pg/mL vs(62.44±34.35)pg/mL,P<0.01]。结论 神经胶质细胞可能通过细胞因子的分泌作用增强EPCs的移行,在EPCs参与的新生血管形成中可能有重要的介导作用。

视网膜血管内皮细胞 第8篇

ROP的发病机制尚未完全清楚。目前研究认为, ROP主要是视网膜血管发育不全和病理性新生血管形成所致。新生血管的形成是极其复杂的生物学过程, 是众多血管因子相互作用、相互调节的结果。血管的正常生长发育, 依靠体内血管生成刺激因子[以血管内皮生长因子 (VEGF) 为代表]和血管生成抑制因子[以色素上皮细胞衍生因子 (PEDF) 为代表]二者共同平衡调节来实现。当它们平衡关系受到破坏, 血管就会出现异常生长[4]。VEGF是血管内皮特异性的生长因子, 在血管生长过程中起中心调控作用。PEDF是视网膜色素上皮细胞分泌的一种蛋白质, 对视网膜存活及血管生长起重要作用。Bouck等[5]发现, PEDF可有效抑制眼新生血管鼠模型中的新生血管生长。至今, 在酸中毒诱导的早产儿视网膜病大鼠动物 (AIR) 模型下, VEGF和PEDF在致异常新生血管发生过程中的变化规律及其与酸中毒的相关性国内未见相关报道。

本实验以血管的正常生长依靠体内血管生成刺激因子和血管生成抑制因子二者共同平衡调节为突破点, 在成功建立AIR模型基础上, 对作用于ROP血管异常生长的两个主要细胞因子———VEGF和PEDF进行较全面研究, 探讨二者在酸中毒致ROP新生血管化进程中所起的作用, 为研究ROP新生血管化的可能机制提供实验依据。

1 材料和方法

1.1动物模型制作与分组

用新生Sprague-Dawley (SD) 大鼠128只, 雌雄不限, 出生体重为6.0~7.0g, 出生24h内分为8组, 每组16只, 与1只母鼠共同饲养。任选其中4组从出生第2天开始采用管饲NH4Cl的方法建立酸中毒模型[6]。另外4组作为同龄正常对照组, 分别在出生后3、5、8、10、13、20d处死动物。

1.2动脉血气测定及视网膜铺片 (ADP酶组织化学法)

两组各时间点分别取6只新生鼠 (12只眼) 进行视网膜铺片, 以观察视网膜血管发育及增生情况。具体方法为:麻醉后打开胸腔, 暴露心脏, 用灌注针头刺入左心室, 抽血0.5~1ml用于血气分析。摘除新生鼠眼球, 固定于4%多聚甲醛溶液中。在眼球角膜缘后约1mm处作环形剪开, 以视乳头为中心, 作4或5个放射状切口。用浓度为0.05mol·L-1、pH值为7.2的Tris-马来酸缓冲液冲洗5次, 每次15min。于37℃反应液中孵育15min后用10%硫化铵反应5min。光学显微镜下观察结果。

1.3病理标本制作

两组各时间点分别选取3只新生鼠 (6只眼) 行颈椎脱臼处死, 摘除眼球并标记方向。具体方法为:摘除的眼球放入4%多聚甲醛溶液中固定24h, 梯度酒精脱水, 二甲苯透明。石蜡切片经常规HE染色, 光学显微镜下观察结果。

1.4视网膜新生血管内皮细胞核计数

每只眼球间断取10个病理切片, 相邻2个切片间隔60μm (10张切片) , 统计平均每只眼球每张切片突破内界膜的血管内皮细胞核数。

1.5 VEGF和PEDF的RT-PCR (二步法)

两组分别选取5、8、10、13d大鼠各6只 (48只眼) 进行取材。采用TaKaRaRNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒进行RT-PCR反应。逆转录反应条件为:42℃30min、99℃5min、5℃5min, 1个循环。PCR反应条件为:94℃2min, 1个循环;94℃30s、54℃60s、72℃2min, 共32个循环。

1.6 PCR产物的检测

取各组的PCR产物5μl, , 在含有0.5μg·ml-1溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳, 凝胶成像系统进行灰度扫描, 记录VEGF、PEDF及相应β-actin的A值, 进行半定量分析。

1.7统计学处理

数据以表示, 统计学处理采用SPSS 13.0软件, 进行2组间t检验;各组间行方差分析, 比较实验组、对照组不同日龄视网膜VEGFmRNA、PEDFmRNA表达的差异, P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各时间点动脉血气情况

见表1。

2.2视网膜血管形态变化

新生大鼠出生时视网膜血管没有发育完全, 随着时间延长, 视网膜血管从中央不断向周边生长, 出生后第20天, 模型组和对照组大鼠的视网膜完全血管化。对照组:幼鼠出生第5天视网膜血管以视乳头为中心, 呈放射状均匀分布, 管径较粗, 周边血管网结构清晰, 可见部分无灌注区。第8、10天时无灌注区逐渐减少;第13天时成熟的毛细血管网几乎覆盖整个视网膜, 自视盘发出的大血管呈放射状均匀分布至视网膜周边, 血管网深浅层结构清晰, 表层血管呈均匀放射状, 深层血管呈多角型网状结构, 第20天时视网膜完全血管化。模型组:出生第5、8天视网膜血管发育滞缓, 管径变细, 分支减少, 中央部及中周部出现大片无灌注区。第10天 (即停止管饲NH4Cl后2d) , 视网膜无灌注区明显减小, 视网膜中周部有较多的新生血管形成, 但血管结构紊乱, 呈片、簇、丛状, 丧失了正常的放射状及多边形网状结构, 视网膜仍有少量无灌注区。见图1。

2.3两组大鼠视网膜血管增生比较

模型组10d龄大鼠HE染色切片显示有较多突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核, 平均每张切片为 (13.88±2.23) 个。而对照组HE切片未见或极少见突破内界膜的血管内皮细胞核, 仅 (0.88±0.84) 个, 两者比较有显著性差异 (t=283.09, P<0.000 1) 。见图2。

2.4不同日龄新生大鼠视网膜VEGFmRNA表达的变化

5日龄模型组视网膜:VEGF/β-actinmRNA吸光度比值 (A值) 与对照组相比差异无显著性 (P>0.05) , 与同组8、10、13日龄大鼠比较差异有显著性 (P<0.05) 。

8日龄模型组视网膜:即酸中毒第8天, VEGF/β-actinmRNA A值比对照组明显下降, 两者差异有显著性 (P<0.05) , 与同组5、10、13日龄大鼠比较差异亦有显著性 (P<0.05) 。

10日龄模型组视网膜:即停管饲NH4Cl后2d, VEGF/β-actinmRNA A值明显上调, 与对照组比较, 差异有显著性 (P<0.05) , 与同组5、8、13日龄大鼠比较差异亦有显著性 (P<0.05) 。

13日龄模型组视网膜:即停管饲NH4Cl后5d, VEGF/β-actinmRNA A值仍较对照组高, 两者比较差异有显著性 (P<0.05) , 但较10日龄时有所降低, 与同组5、8日龄大鼠比较差异亦有显著性 (P<0.05) 。见表2、图2。

与8日龄模型组比较, △P<0.05;与8日龄对照组比较, #P<0.05;与同日龄对照组比较, *P<0.05

(p5、p8、p10、p13分别代表5、8、10、13日龄大鼠)

2.5不同日龄新生大鼠视网膜PEDFmRNA表达的变化

5日龄模型组视网膜:PEDF/β-actinmRNAA值高于对照组, 差异有显著性 (P<0.05) , 与同组8、10、13日龄大鼠比较差异亦有显著性 (P<0.05) 。

8日龄模型组视网膜:即酸中毒第8天, PEDF/β-actinmRNA A值明显升高, 与对照组比较差异有显著性 (P<0.05) , 与同组5、10、13日龄大鼠比较差异亦有显著性 (P<0.05) 。

10日龄模型组视网膜:即停管饲NH4Cl后2d, 实验组PEDF/β-actinmRNA A值呈现下降趋势, 比对照组明显下调, 差异有显著性 (P<0.05) , 与同组5、8、13日龄大鼠比较差异亦有显著性 (P<0.05) 。

13日龄模型组视网膜:实验组PEDF/β-actinmR-NA A值较10日龄时有所升高 (P<0.05) , 基本接近正常水平, 与对照组比较差异无显著性 (P>0.05) , 与同组5、8日龄大鼠比较差异有显著性 (P<0.05) 。见表3、图3。

与同日龄对照组比较, *P<0.05;与8日龄模型组比较, P<0.05;与8日龄对照组比较, #P<0.05

2.6不同日龄新生大鼠视网膜VEGF与PEDFmRNA A值比

见表4。5日龄模型组大鼠视网膜:实验组VEGF与PEDF mRNA A值比低于对照组, 差异有显著性 (P<0.05) , 与同组8、10、13日龄大鼠比较差异亦有显著性 (均P<0.05) 。

8日龄模型组视网膜:VEGF与PEDFmRNA A值比与对照组相比明显降低, 约是对照组的1/12, 差异有显著性 (P<0.05) , 与同组10、13日龄大鼠比较差异亦均有显著性 (均P<0.05) 。

10日龄模型组视网膜:停管饲NH4Cl后2d, 实验组VEGF与PEDFmRNAA值比迅速升高, 明显高于对照组, 约是对照组比值的3.5倍, 差异有显著性 (P<0.05) , 亦明显高于同组5、10、13日龄大鼠 (均P<0.05) 。

13日龄模型组视网膜:VEGF与PEDF mRNA A值比较同组10日龄大鼠有所回落 (P<0.05) , 但仍高于对照组, 两组比较差异有显著性 (P<0.05) , 亦明显高于同组5、8日龄大鼠 (均P<0.05) 。

与同日龄对照组比较, *P<0.05;与8日龄模型组比较, P<0.05;与8日龄对照组比较, #P<0.05

3讨论

本实验选用SD新生大鼠作为诱导视网膜新生血管的模型动物, 是因产后3d内的新生鼠视网膜发育与人孕36周胎儿相似[7], 可作为研究早产儿视网膜发育特点的动物模型。同时它具有生长快、繁育性能好、存活率高等优点。

早产、低出生体重儿肾小管不成熟, 分泌H+的功能差, 排出HCO 3-的阈值低, 容易发生代谢性酸中毒。研究显示, 酸中毒可作为ROP一个独立的危险因素[3]。正常大鼠血气pH值为7.46±0.01[8]。本实验模型组在管饲NH4Cl期间行动脉血气分析, 结果示pH值明显低于正常参考值, 处于酸中毒状态, 证明建模成功。Chen等[9]的酸中毒模型结果显示, 酸中毒可引起新生鼠视网膜新生血管形成, 酸中毒的持续时间越长, 新生血管形成的发生率越高 (酸中毒1、3、6d, 新生血管形成的发生率分别为34%、38%和55%) , 并且在酸中毒后的2~5d发生率最高。在本实验中, 模型组新生大鼠在酸中毒后第2天视网膜血管出现明显的病理性生长, 突破内界膜的新生血管内皮细胞核数明显超过对照组, 提示模型组大鼠从酸中毒状态下回到正常血气状态时, 引起了视网膜新生血管的明显生长, 这与Chen等[9]的研究结果相符。ADP酶组织染色结果显示, 实验组视网膜血管出现了两个阶段的变化:新生大鼠在酸中毒环境中7d后, 视网膜血管化进程推迟, 视网膜血管收缩、闭塞, 发育不良, 出现大片的无灌注区;停止管饲NH4Cl 2d后, 血管出现代偿性的扩张、迂曲, 并形成了大量新生血管, 以缓解视网膜的缺氧缺血状态, 但新生血管出现了形态结构异常, 呈现病理性生长, 其视网膜血管的改变符合ROP的病理过程。本实验模型组大鼠的视网膜新生血管发生在视网膜血管区与无血管区的交界处, 类似于人类ROP中新生血管的发生部位[10]。目前, 酸中毒致视网膜异常新生血管的机制尚不完全清楚, 其可能的机制是:酸中毒引起VEGFmRNA下调, pH值波动使VEGF短暂上调, 导致新生血管形成。

ROP的特征是视网膜的异常新生血管化, 新生血管的形成在其发生发展中起主导作用。血管生成是一个复杂的过程, 多种细胞因子参与新生血管生成的调控。

VEGF是目前已知的功能最强的血管生成促进因子, 它是血管内皮特异性的生长因子, 在血管生长过程中起中心调控作用。Ohno-Matsui等[11]在用视紫红质启动子启动的VEGF转基因鼠研究中发现, VEGF高水平的表达会引起成年大鼠明显的视网膜新生血管形成和牵拉性视网膜脱离。在本实验过程中, 我们看到酸中毒诱导ROP模型组新生大鼠视网膜VEGFmRNA的表达水平与对照组相比有显著改变。酸中毒期间, ROP模型大鼠视网膜VEGFmRNA表达显著下降, 处于低水平表达状态, 酸中毒使VEGF的基因表达受到抑制, 这个时期ROP模型组大鼠视网膜血管普遍出现收缩、闭塞, 可以看出酸中毒对VEGF表达的抑制影响了ROP模型组大鼠视网膜血管的正常发育进程, 使之发育滞缓。当脱离酸中毒环境后, VEGFmRNA表达水平迅速上调, 超过了正常同龄大鼠的VEGF水平, 视网膜血管也随之表现为过度活跃增生。可见VEGF在ROP模型大鼠视网膜上的表达强度与视网膜新生血管的发生呈明确的时空对应关系。据此我们可以推断, VEGF表达的变化在酸中毒导致的血管关闭和消失以及增生过程中起着重要媒介作用, 与血管发育的活跃程度以及血管增生强度有密切关系。

正常组织血管的稳态生长发育是新生血管促进因素和抑制因素这两者相互制约平衡、共同作用的结果, 以VEGF为代表的血管生长促进因素并不是惟一起作用的因素[12]。

PEDF是一种主要存在于眼组织的内源性新生血管抑制因子。1989年, Tombran等[13]首次将其从色素上皮中提纯并克隆。Matsuoka等[14]研究发现, PEDF还具有强大的血管生长抑制功能。本实验从PEDF mRNA水平检测PEDF在酸中毒诱导ROP大鼠模型视网膜中的动态表达变化, 探讨PEDF与视网膜新生血管生成的相关性。实验结果显示, 5日和8日龄ROP模型组大鼠处于酸中毒状态时, 视网膜PEDFmRNA的表达是上调的, 此时期视网膜血管收缩、闭塞, 处于生长滞缓阶段。而停止管饲NH4Cl后, 即10日、13日龄ROP模型组大鼠视网膜PEDFmRNA的表达呈现明显的下调, 而此时期视网膜血管的生长则表现得非常活跃, 出现大量的新生血管。在正常新生大鼠视网膜中, PEDF的变化趋势同样与视网膜血管的生长有密切关联。通过两组大鼠的实验对比不难发现, PEDF的变化趋势与同期视网膜血管生长状态处于同步, 8日龄ROP模型组大鼠PEDF表达处于最高水平, 而此时视网膜血管生长处于最低水平;当10日龄PEDF表达处于最低谷时, ROP模型组大鼠视网膜血管的生长处于最活跃期, 这表明PEDF与视网膜新生血管的形成有非常密切的关系。我们据此推测, 酸中毒诱导的视网膜新生血管的产生不仅是由于VEGF的增多, 而且也和PEDF的下降密切相关。作为目前抗血管生成作用最强的细胞因子, PEDF表达水平的下调可能是参与视网膜新生血管生成的重要因素之一。

从本实验结果可见, ROP模型大鼠在酸中毒期间, VEGF表达下调, PEDF表达上调, 停止管饲NH4Cl后VEGF表达上调, PEDF表达相应下调, 这导致了VEGF/PEDF值在酸中毒期间明显低于对照组, 在酸中毒后高于对照组。据此我们可以推断, VEGF/PEDF的表达平衡失调在酸中毒诱导ROP新生血管生成过程中起重要作用。

总之, 本研究明确了在代谢性酸中毒引起的视网膜新生血管动物模型中, 视网膜血管化的程度和新生血管随时间的发展而变化, 在酸中毒期, VEGF表达下调, 而PEDF表达上调, 视网膜血管发育受到抑制;在停止酸中毒后VEGF表达上调, PEDF下调, 此时视网膜异常新生血管形成明显。通过本实验可以看出, VEGF、PEDF之间的异常变化在视网膜异常新生血管形成过程中发挥重要作用。这为今后早产儿ROP发病机制的研究奠定了一定的实验基础。但由于新生血管的形成是极其复杂的生物学过程, 是众多血管因子相互作用、相互调节的结果, 本实验仅进行了VEGF、PEDF与血管内皮细胞核的关系, 本课题组在进一步的研究中将关注其他细胞因子在ROP异常新生血管形成中的作用, 以期进一步了解ROP的发病机制, 为有效的内科干预手段提供实验依据。

摘要：目的建立酸中毒诱导早产儿视网膜病 (ROP) 大鼠动物 (AIR) 模型, 观察血管内皮生长因子 (VEGF) 、色素上皮衍生因子 (PEDF) 在正常新生大鼠及ROP模型大鼠视网膜中的表达变化规律, 探讨二者表达变化与酸中毒的关系、对视网膜血管发育的作用以及在酸中毒诱导ROP进程中的作用。方法1日龄SD新生大鼠随机分为酸中毒诱导模型组 (ROP组) 和正常对照组。应用逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) 测定全视网膜VEGF、PEDF的mRNA水平。结果RT-PCR结果显示, 8日龄ROP大鼠VEGF mRNA转录水平明显低于C组 (P<0.05) , 停止管饲NH4Cl后ROP组VEGFmRNA转录水平逐渐增强, 10日龄、13日龄ROP大鼠视网膜VEGF mRNA转录水平明显上升, 较对照组明显增强 (P<0.05) 。5日龄、8日龄ROP大鼠视网膜PEDF mRNA表达水平明显高于对照组 (P<0.05) , 而在停止管饲NH4Cl的10日龄、13日龄视网膜中其表达水平低于对照组 (P<0.05) 。在实验过程中PEDF mRNA的表达趋势与VEGF相反;ROP组大鼠在酸中毒期间其VEGF mRNA/PEDF mRNA之值明显降低, 停止管饲NH4Cl后, VEGF mRNA/PEDF mRNA之值升高, 与对照组相比差异有显著性 (P<0.05) 。结论酸中毒使VEGF mRNA表达下调, PEDF mRNA表达上调;停止管饲NH4Cl后二者表达的影响与酸中毒时相反;VEGF、PEDF可能在视网膜正常血管发育及ROP的新生血管化进程中起重要作用, 二者比率变化过程与视网膜新生血管发展进程有关。