当检品有抑菌性时, 它们会掩盖无菌药品已受污染的事实或造成低于实际污染水平的菌检结果, 双醋瑞因本身含有抑菌性, 为保证检查方法的准确性, 必须先消除其抑菌性, 消除抑菌性的方法有很多, 比如增加稀释液体积, 加入中和剂, 薄膜过滤法等等。本文主要采用薄膜过滤法对双醋瑞因的微生物计数方法和控制菌检查方法进行研究, 从而确认通过该方法检验样品不会对微生物检验后果产生任何影响。
1 材料和方法
1.1 实验材料与仪器设备
1.1.1 培养基:胰酪大豆胨琼脂、沙氏葡萄糖琼脂、胰酪大豆胨液体、沙氏葡萄糖液体、麦康凯液体、麦康凯琼脂
1.1.2 稀释液:p H7.0氯化钠蛋白胨缓冲液 (样品品稀释) 、0, 9%的Na Cl (菌种稀释)
1.1.3 实验菌株:金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉
1.1.4实验设备:垂直双人净化工作台、生物安全柜、霉菌培养箱、生化培养箱、立式蒸汽灭菌器、电热恒温干燥箱、微生物限度检验仪。
1.2 实验前准备
所有容器、用具经过处理, 160℃干烘2小时。培养基于高压蒸汽灭菌器中按照适宜的温度灭菌并进行过培养基适用性检查, 整个操作过程中避免微生物污染。
1.3 方法研究
1.3.1 微生物计数法方法适用性研究
1.3.1. 1 供试液的制备:
称取样品10g, 加入100ml p H7.0氯化钠~蛋白胨缓冲液, 摇匀, 静置, 作为供试液1∶10。
1.3.1. 2 接种和稀释
(1) 试验组:取 (1:10) 样品上清液1ml, 薄膜过滤法, 用400ml稀释液分4次冲洗, 最后一次冲洗加入不大于100cfu的试验菌1ml, 抽滤, 取出滤膜冲洗面朝上贴于培养基上。 (A组)
(2) 菌液组:取试验菌不大于100cfu, 薄膜过滤法, 用稀释液少量冲洗, 抽滤, 取出滤膜冲洗面朝上贴于培养基上 (B组) 。
(3) 供试品对照组:取 (1:10) 供试液上清液1ml, 薄膜过滤法, 用400ml稀释液分4次冲洗抽滤, 取出滤膜冲洗面朝上贴于培养基上。 (C组)
1.3.1. 3 需氧菌计数方法适用性研究:
以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉为试验菌株, 照A组、B组、C组滤膜制备方法, 分别制备滤膜, 贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上, 置于30~35℃培养箱中培养。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌平皿培养3天;白色念珠菌、黑曲霉、C组平皿培养5天。
1.3.1. 4 霉菌和酵母菌计数方法适用性验证:
以白色念珠菌、黑曲霉为试验菌株, 照A组、B组、C组滤膜制备方法, 分别制备滤膜, 贴于沙氏葡萄糖琼脂平板上, 置于霉菌培养箱中20~25℃培养5天。
1.3.2 控制菌检查法 (大肠埃希菌) 方法适用性研究
1.3.2. 1 验证菌种:
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌。
1.3.2. 2 供试液制备和增菌培养
(1) 试验组 (促生长能力试验)
取1∶10供试液上清液10ml, 薄膜过滤, 用400ml稀释液分4次冲洗, 最后一次冲洗加入不大于100cfu的大肠埃希菌1ml, 取出滤膜置于100ml的胰酪大豆胨液体培养基中。 (A组)
(2) 阴性菌对照组 (抑制能力试验)
取1∶10供试液上清液10ml, 置于薄膜过滤器中, 用400ml稀释液分4次冲洗, 最后一次冲洗加入不大于100cfu的金黄色葡萄球菌1ml, 取出滤膜置于100ml的胰酪大豆胨液体培养基中。 (B组)
(3) 供试品对照组
取1∶10供试液10ml置于薄膜过滤器中, 用400ml稀释液分4次冲洗, 抽滤, 取出滤膜置于100ml的胰酪大豆胨液体培养基中。 (C组)
(4) 阳性菌液组
取不大于100cfu的大肠埃希菌1ml, 薄膜过滤法, 少量冲洗, 取出滤膜置于100ml的胰酪大豆胨液体培养基中。 (D组)
1.3.2. 3 选择和分离培养
将上述A、B、C、D组置于恒温培养箱中30~35℃培养18小时, 取上述培养物1ml分别接种至100ml麦康凯液体培养基中, 42~44℃培养24小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上30~35℃培养18小时, 观察结果。
2 结语
2.1取三个批次的双醋瑞因样品进行实验, 按照培养情况计数每个平皿的菌落数, 试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组的菌数比值均在0.5~2范围内。各试验菌的回收试验均符合要求, 确认该方法可进行双醋瑞因的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。
2.2在上述培养时间下进行观察, 可检出所加试验菌相应的反应特征即试验组应检出试验菌、阴性菌对照组未检出阴性对照菌。确认该方法可进行双醋瑞因的控制菌检查。
2.3通过上述研究可以确定通过薄膜过滤法检查双醋瑞因的微生物限度可以消除双醋瑞因的抑菌性, 使得双醋瑞因对微生物限度检查结果不会产生任何影响。薄膜法操作起来比较简便, 可以满足双醋瑞因日常生产中的检测需求。
摘要：采用薄膜过滤法消除双醋瑞因的抑菌性, 进行微生物限度检验方法的研究, 确认需氧菌、霉菌和酵母菌以及控制菌的检测方法, 从而获得更真实的检测数据, 以满足双醋瑞因的日常检测需求。
关键词：薄膜过滤法,微生物计数法,控制菌检查法
参考文献
[1] 张红丹, 郭莹, 孙丽艳.探讨影响药品微生物限度检验结果的因素[J].生物技术世界, 2014年第11期.
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