灌注式生物反应器论文

灌注式生物反应器论文（精选4篇）

灌注式生物反应器论文 第1篇

目前, 普遍采用的是传统的转瓶生产工艺, 但转瓶劳动强度高, 车间占地面积大, 易污染, 产量低, 且质量不易控制。生物反应器培养因其可控制细胞培养环境和营养条件, 产品质量易于控制, 易于实现工业化大规模生产, 因而成为今后疫苗生产的发展方向。采用微载体大规模培养贴壁细胞模式被应用于工业化生产[2], 虽然已成为很有效的模式[3], 但目前常用的微载体使用前后处理麻烦, 价格昂贵, 并且该培养模式对设备和微载体的要求都很高, 细胞的生长代谢常常受到微载体浓度的限制[4]。NBS吊篮生物反应器是目前另一种被广泛采用的生物反应器, 通过添加酯片载体来增加细胞吸附生长面积, 从而实现高密度培养的目的, 但是该系列反应器放大的问题难于解决, 其最大的14 L反应器 (500 g酯片载量) 大大限制了规模的进一步扩大, 而昂贵的设备及酯片价格, 极大地提高了疫苗产品的投资成本及生产成本。

本实验采用全部国产的细胞载体和一次性激流—灌注式生物反应器[5], 该反应器灌注培养系统采用外循环式细胞载体灌注培养工艺, 将载体培养袋固定于反应器外, 通过蠕动泵及重力作用实现培养液供给细胞正常生长代谢所需要的养分, 带走代谢产物, 利用激流式生物反应器在线监控溶氧[6]、pH、温度等条件, 为细胞生长创造有利环境。该培养工艺的主要优势在于:操作方便, 细胞生长快, 存活能力稳定, 一次性灌注细胞培养袋的细胞容易冲洗和胰酶消化, 解决逐级放大的接种问题, 并且重力作用的培养模式, 可实现大量细胞载体的添加, 10 L反应器含150 g细胞载体, 100 L反应器含1 500 g细胞载体, 600 L反应器含7 200 g细胞载体。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

DMEM高糖培养基, GIBCO 12800;V001无血清培养基 (葡萄糖含量2 g/L) , 本公司自制;胎牛血清, 武汉三利;胰酶, Sigma T4799。

Vero细胞, 由华北制药集团新药研究开发有限责任公司提供。

葡萄糖测定试剂盒, 上海荣盛生物科技有限公司, CAT 261500。

20 m L、220 m L纸片载体转管 (如图1、图2) , 杭州安普生物工程有限公司, 载体量分别为0.6 g和6 g。

一次性细胞培养袋:激流细胞培养袋、灌注细胞培养袋 (如图3、图4) , 杭州安普生物工程有限公司。

培养基储液袋:10 L、50 L (如图5) , 杭州安普生物工程有限公司。

1.2 主要仪器

CO2培养箱, Forma 3110。

分光光度计, Amersham Ultrospec 2100 pro。

显微镜, Fisher Scientific

微型反应器, 杭州安普生物工程有限公司。

AP20 (10 L) 、AP200 (100 L) 激流—灌注生物反应器, 杭州安普生物工程有限公司, 细胞载体量分别为150 g和1 200 g。反应器结构 (分别为灌注系统、激流式生物反应器、控制器) 如图6所示。

1.3 方法

1.3.1 种子链扩增

Vero细胞培养, 生长液为DMEM+10%胎牛血清 (FBS) , 37℃, 5%CO2。

按一定密度接种于T75方瓶中, 当细胞长满90%以上时, 胰酶消化细胞, 用20～30 m L生长液重悬细胞 (1.0×107个) 接种至20 m L纸片载体转管。接种后每天换液, 并监测培养液中葡萄糖含量, 培养7天后日糖耗趋于平稳, 使用胰酶消化[弃去生长液, 加入20 m L PBS浸没润洗两次, 弃去, 加入胰酶15 m L, 放入微型反应器旋转, 37℃, 20 min, 取出转管震荡, 收集细胞液 (在收集瓶中预先加入生长液) , 重复2次, 离心弃去胰酶]收集细胞血球计数板计数。

将1个20 m L纸片载体转管收获细胞转接至1个220 m L纸片载体转管, 接种量约为1.0×108个细胞, 培养液体积200～300 m L, 培养方法与消化方法同20 m L纸片转管。

将1个220 m L纸片载体转管消化的细胞接种AP20生物反应器 (种子罐) 。接种量约为1.5×109个细胞, 温度37℃, 控制DO 50%～60%, pH 7.2～7.4, 初始接种体积为6～8 L, 最大工作体积10 L, 通过监测残糖量确定流加补料及换液情况, 使葡萄糖维持在2 g/L以上, 待日糖耗趋于平稳时, 胰酶消化[把所有培养液打入储液袋, 弃去, 将PBS通过蠕动泵打入灌注培养袋至2/3位置, 浸润摇晃后弃去, 重复1次, 打入2 L胰酶, 反复震荡20 min, 待胰酶混浊, 将细胞悬液打入激流反应器 (预先打入生长液) , 重复2次]取样计数。

1.3.2 AP200激流—灌注式反应器培养

将AP20与AP200的激流反应器部分用快接头相连, 通过蠕动泵将细胞打入AP200反应器。接种量约为1.5×1010个细胞, 初始接种体积为50～60 L, 最大工作体积100 L, 培养方法同AP20反应器, 细胞计数时采用灌注袋不同位置取1 g纸片, 胰酶消化, 血球计数板计数, 推算1 200 g细胞载体总细胞量。

1.3.3 连续灌注培养维持时间研究

种子链扩增至AP200反应器, 方法同上。每日检测葡萄糖消耗量, 待耗糖不再明显增加, 约12天, 生长液全部排出, PBS润洗2次, 换为V001维持液, 培养温度降至35℃, pH7.4～7.8, DO50%～60%。连续灌注培养以维持细胞生长, 反应器灌注流量根据培养液中残余葡萄糖含量进行调整, 由于细胞不断老化脱落, 代谢减缓, 逐步降低灌注速度, 待细胞大量脱落, 终止实验。

2 结果

2.1 种子链扩增

2.1.1 20 m L纸片载体转管

接种量为1×107个细胞, 每天换液并检测残糖量, 曲线如图7。生长7天后糖耗达到最大, 胰酶消化得到2.3×108个细胞, 显微镜观察, 细胞透亮, 外壁清晰, 活率在95%以上, 细胞倍增23倍, 将1.0×108个细胞转接至1个220 m L纸片载体转管。

2.1.2 220 m L纸片载体转管

接种量为1×108个细胞, 每天换液并检测残糖量, 曲线如图8。生长6天后胰酶消化, 得到1.5×109个细胞, 显微镜观察, 细胞透亮, 外壁清晰, 活率在95%以上, 细胞倍增15倍, 将细胞全部接种至AP20反应器。

2.1.3 AP20激流—灌注式反应器

接种量1.5×109 cells, 根据葡萄糖含量采用流加补料或换液处理的方式, 保持残糖量在2.0 g/L左右, 培养工艺如图9所示。反应器自动控制培养条件, 激流反应器转速55 r/min, 培养基循环速度为450～550 m L/min, 培养时间6天, 第2天全部换液, 第4天流加补料3 L, 第5天全部换液, 第6天胰酶消化灌注细胞培养袋, 最终收获16.0×109个细胞, 状态良好, 活率在90%以上, 细胞增殖10倍, 总共灌注培养液22 L。

2.2 AP200激流—灌注式反应器

接种量1.5×1010 cells, 残糖控制在2.0 g/L左右, 培养工艺如图10。反应器自动控制培养条件, 摇床转速35 r/min, 循环速度500 m L/min, 培养9天时间, 第3天换液30 L, 第5天换液30 L, 第6天换液30 L, 第7天换液60 L, 第7天补糖1.8 g/L, 总共灌注培养液150 L。

从灌注袋侧面自上至下3个位置, 每处取约1 g纸片, 中部也从上至下取3处纸片, 如图11所示, 消化纸片上细胞, 计算每克纸片细胞量, 平均值为3.73×108个/g, 推算出总细胞量44.8×1010个 (3.73×108/g×1 200 g) , 细胞增殖30倍。从细胞量看, 各点细胞分布基本均匀。

2.3 生长期向维持期的转换

根据耗糖情况, AP200在细胞密度达到约7×106cells/m L时, 将培养液换为V001维持液。早期葡萄糖消耗量基本维持平衡, 直到20天以后消耗量降低。整个过程根据耗糖情况逐渐降低灌注流量, 总共维持24天时间, 收获约10个工作体积培养液。葡萄糖含量及灌注流量曲线如图12。维持期终止后, 灌注培养袋各点取约1 g纸片, 消化计数, 细胞量约3.0×108个/g, 活率>70%。

3 分析与讨论

传统转瓶生产工艺是目前成熟的Vero及其他疫苗基质细胞培养方法, 但由于操作繁琐, 传代环节多, 易污染以及产品质量难于控制是其大规模应用的主要障碍。微载体培养贴壁细胞是迄今最常用最有效的方法, 以Cytodex系列应用最广, 但微载体使用前后均有较复杂的处理步骤, 并且细胞的增殖也受到剪切力、代谢物的积累等因素影响。激流—灌注式生物反应器采用纸片载体培养模式, 纸片载体呈三维立体结构 (如图13、图14所示) , 可增加细胞吸附生长面积。该模式易于细胞生长及营养供给, 培养过程可采用连续灌注培养, 不断加入新鲜培养液的同时排出旧液, 能有效、及时供给营养除去代谢产物, 使细胞始终处于良好的营养状态, 适用于高密度细胞培养, 同时延长细胞维持时间, 有利于病毒的持续繁殖, 提高疫苗产量。

激流—灌注式生物反应器可解决大培养贴壁培养的问题, 1个AP200纸片载体灌注系统的细胞量相当于1 200个大转瓶的生产车间, 而AP1200拥有7 200 g细胞载体量。另外该设备空间占用少、操作简便。所有耗材经过γ射线照射, 一次性使用, 极大地降低劳动强度, 缩短批间处理周期, 极大地提高工作效率, 特别适合于大规模人用、兽用疫苗生产。

摘要：反应器培养Vero细胞以微载体 (Cytodex等载体) 及NBS公司CellGen310酯片培养为主, 培养工艺对设备、技术要求高, 一次性投资大, 微载体和酯片处理繁琐, 耗材价格昂贵, 生产成本高。实验采用一次性激流-灌注式生物反应器大规模培养Vero细胞, 通过控制DO、pH等条件, 开发出便捷、稳定的大规模培养工艺, 为疫苗工业采用大规模细胞培养工艺生产疫苗奠定基础。

关键词：Vero细胞,大规模细胞培养,一次性生物反应器,激流—灌注式生物反应器

参考文献

[1]王佃亮, 肖成祖.Vero细胞在生物工程中的应用及其高密度培养.生物技术通讯, 1994, 5 (3) :130～133

[2]李平忠, 沈伟, 余芬, 等.用微载体培养Vero细胞制备狂犬疫苗.第三军医大学学报, 2006, 28 (23) :2374～2376

[3]张立, 严春, 范卫民, 等.Vero细胞的微载体培养——放大过程中的接种工艺.华东理工大学学报, 1998, 24 (6) :659～663

[4]刘轶, 朱国强.动物细胞培养及微载体技术研究进展.吉林农业大学学报, 2007, 29 (2) :203～206

[5]Li Luanfeng, et al.A Single-Use, Scalable Perfus-ion Bioreactor System.BioProcess Int.2009, 6:46～54

灌注式生物反应器论文 第2篇

摘要：使用透水混凝土生态膜作填料,利用渠式生物膜反应器,对生活污水进行处理.结合实验数据,对新型反应器中填料上生物膜的活性进行了分析.实验表明,其活性(以耗氧速率SOUR表示)在3.23～6.25 mgO2/g・h之间,其生物膜量在3.16～1 0.72mg/cm2之间,生物膜量的变化趋势是沿程下降,而SOUR却是上升的.作 者：邹长伟 金腊华 万雨龙 袁杰 ZOU Chang-wei JIN La-hua WAN Yu-long YUAN Jie 作者单位：邹长伟,ZOU Chang-wei(南昌大学环境科学与工程学院,江西,南昌,330029)

金腊华,万雨龙,袁杰,JIN La-hua,WAN Yu-long,YUAN Jie(暨南大学环境工程系,广东,广州,510632)

期 刊：水处理技术 ISTICPKU Journal：TECHNOLOGY OF WATER TREATMENT年，卷(期)：,32(11)分类号：X703.1关键词：渠式生物膜反应器 生物膜量 微生物活性

灌注式生物反应器论文 第3篇

浸没式膜生物反应器 (SMBR) 凭借占地面积小、出水水质优良等特点已在污水处理领域得到了广泛的研究和应用。而在饮用水处理领域, 浸没式膜生物反应器 (SMBR) 技术还相对较新。

据李圭白介绍, 浸没式膜生物反应器 (SMBR) 由于通过底部曝气, 可使反应器内始终保持充足的溶解氧, 因而对高氨氮原水的处理效果明显优于生物活性炭工艺 (BAC) , 所以可以更好地解决水源水中的氨氮污染问题, 包括突发性的氨氮冲击负荷。

而生物活性炭工艺 (BAC) 则因通过活性炭吸附和生物降解的协同作用可更高效地去除水中溶解性有机物。所以, 研究人员尝试在浸没式膜生物反应器 (SMBR) 中投加粉末活性炭 (PAC) , 构建出膜-粉末炭吸附生物反应器 (MABR) , 以强化对溶解性有机物的去除。实验结果表明, 在UF膜截留、微生物降解、粉末炭吸附的共同作用下, BDOC去除率为70.1%;AOC的去除率为48.5%, 而应用浸没式膜生物反应器 (SMBR) , BDOC和AOC两者的去除率分别仅为69.8%和44.3%。

此外, 为进一步去除以憎水性大分子有机物为主的有机物, 研究人员又尝试在浸没式膜生物反应器 (SMBR) 中直接投加混凝剂, 构建出膜混凝生物反应器 (MCBR) 。实验表明:在生物反应器中直接进行混凝并不会对反应器中的微生物群落造成不良影响, 而且在反应器中投加聚合氯化铝 (PACl) 进行混凝后, 膜混凝生物反应器 (MCBR) 对溶解性硫酸盐的去除效率比浸没式膜生物反应器 (SMBR) 提高了76.9个百分点, 同时, 出水中几乎检测不到磷, 使得出水生物稳定性得到显著提高。

厌氧生物膜序批式反应器新工艺 第4篇

厌氧生物膜序批式反应器新工艺

本文论述了ASBR的.改进工艺,厌氧生物膜序批式反应器(ABSBR)新工艺的研究现状,设计构想,工艺原理及优点,展望了ABSBR新工艺在我国现有国情下研究开发的意义.

作 者：吴速英 叶雪均 WU Su-ying Ye Xue-jun 作者单位：江西理工大学,材料化学学院,江西,赣州,341000刊 名：水处理技术 ISTIC PKU英文刊名：TECHNOLOGY OF WATER TREATMENT年，卷(期)：31(8)分类号：X703关键词：ABSBR ASBR 生物膜 厌氧