红平菇 (Pleurotus djamor) 是担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、口蘑科、侧耳属的一种木材腐朽真菌, 原产于热带和亚热带地区, 夏秋季节生长在多种阔叶树的枯干上, 也能生长在棕榈、橡胶树和竹子上, 在世界上许多热带和亚热带地区均有分布[1,2,3]。红平菇属于珍稀蕈菌, 具有很高的食药用价值和观赏价值, 子实体营养丰富, 高蛋白、低脂肪, 纤维素含量达到25%以上, 且含多种人体必需的氨基酸、维生素和矿物质, 具有抗肿瘤、抗菌、提高机体免疫力等功能, 产量与生物学效率高[4,5,6,7,8]。
近二十多年来, 国内对红平菇的研究开展得比较广泛。1991年, 河北农业大学园艺系的李明等人从泰国引进一株高温型T1红平菇, 通过3年的研究, 掌握了该菌株的生物学特性[7]。1994年, 胡文华在红平菇YPH9菌株栽培技术上进行了一些摸索[9];同年, 李中岳发表了红平菇C903菌株人工栽培的报道[10]。1996年, 柳会珍也对红平菇C903菌株的栽培技术进行了报道[11]。1995年, 张其昌等对红平菇RQ-1菌株进行了营养成分分析[12]。2000年, 赖万年进行了红平菇深层发酵培养的研究, 也对红平菇在哈尔滨乃至东北地区液体菌种栽培技术进行了研究[13]。2009年, 池玉杰和闫洪波对红平菇木质素降解酶、锰过氧化物酶等进行了检测[14]。但关于红平菇酶活力测定方面的研究报道还很少。本实验通过采用响应面法摸索最适的测定淀粉酶活力的条件, 以期为更好地测定红平菇淀粉酶活力提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌种及其来源
供试红平菇菌种为实验室保藏, 菌种于4℃保存于PDA斜面培养基上。
1.1.2 主要试剂及仪器
酒石酸钾钠、氢氧化钠、苯酚、亚硫酸钠、磷酸二氢钠和柠檬酸等试剂均为国产分析纯试剂。主要仪器有恒温烘箱、分光光度计、p H计等。
1.1.3 红平菇发酵液的制备
红平菇菌种活化后, 接入液体发酵培养基, 28℃, 165 r/min恒温摇床培养, 用抽提机抽提第9天的液体菌种滤液作为酶液。用3, 5-二硝基水杨酸 (DNS) 比色皿法来测定淀粉酶活力。
1.2 实验方法
1.2.1 标准曲线的绘制[15]
1.2.1. 1 葡萄糖标准曲线
配制0.5 mg/m L葡萄糖溶液作为标准样, 在一系列管中分别加入3 m L DNS以及不同配比的葡萄糖标准液和蒸馏水, 在沸水浴中加热5 min, 冷却后定容至25 m L。在550 nm波长下测其吸光值, OD550作为横坐标, 葡萄糖含量 (mg/m L) 作为纵坐标, 绘制标准曲线 (图1) 。
1.2.1. 2 麦芽糖标准曲线
配制1 mg/m L麦芽糖溶液作为标准样, 在一系列管中分别加入3 m L DNS以及不同配比的麦芽糖标准液和蒸馏水, 在沸水浴中加热5 min, 冷却后定容至25 m L。在520 nm波长下测其吸光值, OD520作为横坐标, 麦芽糖含量 (mg/m L) 作为纵坐标, 绘制标准曲线 (图2) 。
1.2.2 缓冲溶液的配制
配制磷酸二氢钠和柠檬酸缓冲溶液, 首先称取一定量磷酸二氢钠溶于水, 将磷酸二氢钠溶液定容到1000 m L摇匀;然后再称一定量的柠檬酸溶于水, 将柠檬酸溶液也定容到1000 m L;最后通过控制2种溶液加入的量, 配制成p H值为4.0, 4.4, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0的六个不同p H值缓冲溶液。
1.2.3 淀粉酶活力测定的单因素试验
选取红平菇出菇第9天测其淀粉酶活力。依次以p H、温度及酶量3个因素做单因素实验, 测定3个因素的变化对淀粉酶活力的影响[16,17]。
1.2.4 响应面法实验中因素水平对淀粉酶活力的影响
采用依据“1.2.3”单因素实验的结果用design-exper软件设计出来的三因素三水平的响应面法, 对淀粉酶活力测定条件进行优化[18], 其实验因子和水平见表1。
2 结果与分析
2.1 p H对淀粉酶活力的影响
由表2可见, p H值为6.0时淀粉酶活力最大, p H值小于或者大于6.0, 都会抑制酶的活性。
2.2 温度对淀粉酶活力的影响
由表2可见, 淀粉酶活力测定的最适温度为70℃, 温度低于这个值, 酶不能充分激活, 温度高于这个值, 酶活力就降低了。
2.3 酶量对淀粉酶活力的影响
由表2可见, 当酶量为1.2 m L时淀粉酶活力最大。
2.4 响应面实验中各因素水平对淀粉酶活力的影响
在单因子实验的基础上, 按照上面的响应面水平和实验因子进行响应面实验, 结果见表3。
采用design-expert软件进行方差分析[18], 分析结果见表4。
模型的校正决定系数R2>99.9999%, 说明这种实验方法是可靠的, 使用该方程模拟真实的三因子三水平的分析是可行的。
由表3的prob值可知, AA、BB、CC对酶活力 (R1) 值的影响非常显著, 表明实验因子对响应值不是简单的线性关系, 二次项影响非常显著, 交互作用的影响相对较小。
图3~图5直观地给出了各个因子交互作用的响应面的3D和等值线分析。从响应面的最高点和等值线可以看出, 在所选的范围内存在极值, 既是响应面的最高点, 同时也是等值线最小椭圆的中心点。
从图3可见, A和B的交互作用较强。温度过高、过低和酶量过少、过多, 可能对会酶活力产生影响。
从图4可见, A和C的交互作用不强, A的编码值在C很大范围内都能得到较大的响应值。温度过高、过低和p H值过高、过底, 可能对会酶活力产生影响。
从图5可见, B和C的交互作用不强, B的编码值在C的很大范围内都有较大的响应值, 因子C对响应值影响最大, 这与方差分析的结果吻合。
由以上响应面分析得出:淀粉酶活力R1的最大值为5.14127 U, 相应的温度A=69.85℃、酶量B=1.20m L、p H C=5.90。
3 小结与讨论
本实验对红平菇淀粉酶活力测定方法进行了优化, 通过响应面法得出DNS法测定酶活力的最适条件为:温度69.85℃, 酶量1.2 m L, p H值5.9。单因素及响应面法得到的红平菇淀粉酶活力测定最适条件, 可为红平菇淀粉酶类的测定和利用提供一定的参考依据, 也可为科学了解红平菇营养生理习性及食用菌工业发酵菌种的选育提供参考依据和分析方法。
摘要：为了优化红平菇淀粉酶活力测定的条件, 从p H值、温度、底物浓度3个方面对测定方法进行了单因素分析, 并利用响应面法进行了3个因子的交互作用分析。结果表明, 测定红平菇淀粉酶活力的最优条件为p H值5.9、温度69.85℃、酶量1.2 m L。
关键词：红平菇,淀粉酶活力,测定条件,优化,响应面法
参考文献
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