谷胱甘肽S-转移酶是超基因家族酶, 为细胞解毒系统的重要成分, 可能保护细胞免受活性氧代谢产物损伤的物质[1～3]。人类GSTθ存在着基因的多态性, 如20%的高加索人和80%的亚洲人缺少这种酶。正因为GSTθ的多态性, 有可能影响到人类发生暴露相关肿瘤的危险性。GSTθ空白基因型在宫颈癌病人非常常见, 在年轻宫颈癌病人的发生较60岁以上病人中更常见。而且, GSTθ空白基因型与低分化肿瘤的相关性更强, 这表明携带这种基因的个体对宫颈癌有较高的遗传易感性[5]。
在本研究中通过将GSTθ基因, 稳定地转染到了人类宫颈癌HeLa细胞, 并观察了转染后GSTθ高水平表达对细胞生长及细胞侵袭能力的影响, 以了解GSTθ基因改变可能对肿瘤细胞的生物学作用, 从而为GSTθ基因作为肿瘤抑制基因为肿瘤基因治疗提供实验基础和依据。
1 材料与方法
1.1 材料
人类宫颈癌HeLa细胞株购自美国ATCC菌种保藏中心, 新生小牛血清 (美国Gibco) , DMEM冻干粉 (美国Gibco) , MTT (普飞生物科技公司) , DMSO (国药集团) , 酶标仪 (Bio-TEK公司) , CKX41倒置显微镜、C-7070数码相机 (OLYMPUS) , pcDNA3 (美国Invitrogen公司) , Lipofectamine (美国Invitrogen公司) , Trizol (加拿大Bio Basic公司) , 逆转录试剂盒 (加拿大Bio Basic公司) , PCR扩增试剂剂盒 (上海生工) 。
1.2 方法
1.2.1 GSTθ细胞转染和GSTθ高表达稳定细胞的建立
一全长人类GSTθcDNA定向地克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中, 采用脂质体介导转染方法根据其提供的使用说明书将构建好的pcDNA3/GSTθ载体导入HeLa细胞中, 并在含有500μg/mL G418的培养液进一步筛选培养。大约2～3周后, 可见典型的抗G418的克隆形成。克隆细胞再进一步培养和扩展, 最后采用RT-PCR检测克隆细胞中GSTθ基因mRNA表达水平。转染了pcDNA3-GSTθ的HeLa细胞则命名为HeLa-GSTθ。
1.2.2 RT-PCR办法
收集取对数生长期的未转染的HeLa母细胞和HeLa-GSTθ细胞, 采用Trizol按Trizol试剂盒的说明书提取总RNA, 紫外分光光度计分别测定RNA纯度 (A260/A280>1.90) 。用DEPC水调整RNA浓度为5μg/μL。各取总RNA1μL, 加入1μLOligo (dT) , 10μLDEPC水, 轻混70℃水浴5min, 并在冰浴冷却30s。然后在冰上加入4μL5x反应液, 1μLRNase抑制剂 (20U/μL) , 2μLd NTP混合液 (10mmol/L) , 在37℃水浴加热5min, 加入1μLM-Mu LV反转录酶 (20μ/μL) , 在37℃逆转录为1h, 最后在70℃灭活逆转录酶10min, 置-20oC冰箱保存备用。
根据Genebank中GSTθ (GSTT1, NP_000844) 的基因序列, 采用引物设计软件primer premier 5进行引物的设计。引物序列分别为:GSTθ上游引物5’-CCC GGA TCC CGC ATG GGT CTG GAG CTC TAC CTG GAC-3’, 下游引物为5’-GGG GAA TTC CCG GAT CAT GGC CAG CAC CCA GGG-3’, 扩增产物为723bp。GADPH上游引物为5’-CAA CTA CAT GGT CTA CAT GTT CC-3’, 下游引物为5’-CAA CCT GGT CAG TGT AG-3’, 扩增产物为724bp。反应条件为:48℃逆转录45min;94℃灭活及预变性2min;再经58℃45s, 72℃45s, 反应32个循环, 68℃延伸7min。最后, PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳, 在凝胶成像仪上观察并拍照。
1.2.4 细胞记数
采用0.25%胰酶消化收集对数生长期HeLa细胞和HeLa-GSTθ细胞, 细胞计数后制成2×104/mL细胞悬液, 并接种于六孔培养板。细胞然后连续培养8d, 每组设3个复孔, 每天进行细胞计数, 最终绘制生长曲线。
1.2.5 划痕拍照方法
分别取对数生长期的HeLa母细胞和HeLa-GSTθ细胞, 以106/mL的浓度接种于35mm培养皿中, 培养至细胞完全饱和。用无菌200μL的枪头在每皿细胞中划出一条等宽直线细痕, 制作细胞伤口模型;无菌PBS清洗3次以除去漂浮细胞。此时设为划痕后零时, 拍照。继续培养, 每隔24h在显微镜下观察划痕宽度, 采并用数码相机拍照记录。
2 结果
2.1 GSTθ高表达HeLa稳定转染细胞的建立
如图1所示, HeLa母细胞含有低的GSTθmRNA表达水平, 而转染了pcDNA3-GSTθ载体的HeLa-GSTθ稳定细胞中GSTθmRNA的表达则明显提高。这一结果表明GSTθ重组质粒的构建是成功, 并能成功在HeLa细胞中稳定转录和表达GSTθ基因。
2.2 GSTθ高表达降低HeLa细胞的生长
我们比较了He La母细胞和He La-GSTθ细胞的生长。HeLa/GSTθ细胞的生长率明显比HeLa母细胞慢。细胞的倍增时间分别为:HeLa母细胞为18h, 而HeLa/GSTθ细胞则为24h。这说明转染了GSTθ可以延迟HeLa细胞的生长。两条细胞生长曲线逐渐分开。
2.3 GSTθ高表达降低HeLa细胞侵袭转移能力
我们应用划痕拍照方法记录了HeLa母细胞和HeLa GSTθ细胞划痕后向空白区域的侵袭生长能力。72h后, HeLa母细胞已经完全将划痕区域长满, 而HeLa GSTθ细胞划痕区仍有很大空隙, HeLa GSTθ细胞向其他地方侵袭转移的能力明显比HeLa母细胞低。
3 讨论
在本实验中, 我们发现通过GSTθ真核表达质粒pcDNA3-GSTθ稳定转染可以明显地增加宫颈癌HeLa细胞中的GSTθ表达水平, 而GSTθ表达水平的增加导致了HeLa细胞的生长率降低, HeLa-GSTθ细胞的倍增时间从18h增加到了24h。这些结果说明GSTθ基因可能是宫颈癌的抑制基因。
肿瘤细胞的生长一般都有向周围组织侵袭的特性, 宫颈癌细胞也具有这一特性, 临床上常常发现局部晚期的患者, 由于肿瘤的侵犯而导致患者失去治疗的机会。在本实验中, 我们通过实验
证明了转染了GSTθ基因的HeLa-GSTθ细胞侵袭能力明显下降。这一结果说明GSTθ基因有可能降低宫颈癌的恶性程度。
我们所得出的实验, 结果尽管机制还不清楚, 但这些体外研究为将来GSTθ肿瘤的基因治疗提供了实验基础和依据。关于GSTθ基因通过怎样的渠道影响了细胞增殖周期, 其作用的关键点是什么, 以及GSTθ基因是怎样影响了宫颈癌HeLa细胞的侵袭能力是我们正在努力工作研究的方向。
摘要：目的 了解增加GSTθ表达水平对人类宫颈癌HeLa细胞生长及侵袭能力的影响。方法 通过脂质体将pcDNA3-GSTθ真核质粒载体转染获得高GSTθ表达水平的HeLa稳定转染细胞;采用RT-PCR检测GSTθmRNA的表达水平;采用细胞记数和MTT法测定细胞的生长;采用划痕拍照方法观察细胞侵袭能力的改变。结果 GSTθ高水平表达显著地延缓和降低HeLa细胞的生长, 并使HeLa细胞的侵袭能力下降。结论 GSTθ高水平表达可以延缓和降低细胞生长并降低HeLa细胞的侵袭能力。
关键词：GSTθ,HeLa细胞,细胞生长,侵袭
参考文献
[1] Kautenburger T.The gut fermentation product butyrate, a chemopreventive agent, suppresses glutathione S-transferase theta (hGSTT1) and cell growth more in human colon adenoma (LT97) than tumor (HT29) cells[J].Cancer Res Clin Oncol, 2005, 131 (10) :692～700.
[2] Landi S.Mammalian class theta GST and differential susceptibility to carcinogens:a review[J].Mutat Res, 2000, 463 (5) :247～283.
[3] Griswold KE.The evolution of catalytic efficiency and substrate promiscuity in human theta class1-1glutathione transferase[J].Molecular Biol, 2006, 364 (3) :400～410.
[4] Josephy PD.Screening and characterization of variant Theta-classglutathione transferases catalyzing the activation of ethylene dibromide to a mutagen[J].Environ Mol Mutagen, 2006, 47 (9) :657～65.
[5] Hu Y.Induction of DNA-protein crosslinks by dichloromethane in a V79cell line transfected with the murine glutathione-S-trans-ferase theta1gene[J].Mutat Res, 2006, 607 (2) :231～239.
[6] 左石.重组人DNMT1真核表达质粒对胆管癌细胞DNMT1基因mRNA水平及细胞生长曲线的影响[J].中华肝胆外科杂志, 2006, 12 (3) :191～192.
[7] 李小毅.奥曲肽和NC-8-12对人结肠癌细胞株HCT116体外生长的影响[J].中国普外基础与临床杂志, 2005, 1 (12) :25～28.