星形细胞瘤是最常见的中枢神经系统的肿瘤, 占胶质瘤的20%~50%, 平均复发时间为2年半[1]。目前认为肿瘤是一种多基因变化、多步骤发生的细胞周期性疾病[2], Cyclins蛋白是细胞周期调控的重要的癌基因蛋白, 我们应用流式细胞术的DNA/Cyclins双参数分析法检测星形细胞瘤复发前后的Cyclin A, Cyclin B1蛋白的表达, 以探讨星形细胞瘤复发可能存在的细胞周期因子改变。
1 材料与方法
1.1 材料来源
选用我院2002年1月至2010年6月诊断为星形细胞肿瘤, 行开颅肿瘤切除术, 术后均全脑放疗至今已复发, 并行第2次手术的18例患者标本为研究对象, 按WHO2000年中枢神经系统肿瘤分类标准分型分级, 第1次发病时星形细胞瘤Ⅰ~Ⅱ级11例, 星形细胞瘤Ⅲ~Ⅳ级7例, 均位于大脑半球, 第1次发病时未行放疗或化疗。
1.2 方法及步骤
获取的临床肿瘤组织块, 包括正常脑组织 (3例) 、复发前后星形细胞肿瘤组织 (18例) , 用生理盐水洗掉组织块表面血污, 用手术刀剁碎, 200目钢网过滤;, 细胞均以80%冰乙醇固定, -80℃保存。固定细胞与鼠抗人Cyclins (A、B1) 单克隆抗体孵育过夜, 孵育后细胞与标有FITC的二抗孵育30min, 再加入PI和Rnase避光处理20min, 用流式细胞仪 (Becton Dickson, 美国) 检测。阴性对照采用不加一抗的Cyclins设立空白对照其余处理步骤同上 (抗体均购自美国Pharmigen公司) 。应用Mod LTFit2.0软件和CELLQuest软件 (Becton Dickson, 美国) 进行Cyclin A、Cyclin B1表达含量和时相的检测和分析。
1.3 结果判定
Cyclins蛋白表达的定量分析方法:按照Morkve等[3]提出的分析方法, 以荧光指数 (Fluorescencelndex, 简称FI) 表示Cyclins蛋白的相对含量:FI (荧光指数) = (脑肿瘤样品Cyclins蛋白平均荧光强度-对照组平均荧光强度) /正常脑组织Cyclins蛋白平均荧光强度。如FI值>1.0, 为Cyclins蛋白表达阳性, FI<1.0为阴性。
1.4 统计学处理
数据差异显著性用χ2检验。
2 结果
本实验中, 正常的脑组织中Cyclins的表达含量和时相均正常, 在星形细胞瘤中Cyclin A、Cyclin B1, 出现不同程度的异常表达, 包括过度表达及非时相表达, 过度表达指Cyclins表达的含量高于正常对照组, 非时相性表达则是指正常表达于G2期的Cyclins异常地出现在S、G1期中, 本实验共检测18对星形细胞瘤复发前后标本, Cyclin A在原发星形细胞瘤中的异常表达有7例, 占38.8%, 其中2例有非时相表达, 在复发星形细胞瘤中的异常表达有15例, 占83.3%, 其中8例有非时相表达, Cyclin A阳性率在星形细胞瘤复发前后有显著性差异 (P<0.01) ;Cyclin B1在原发星形细胞瘤中的异常表达有6例, 占33.3%, 其中3例有非时相表达, 在复发星形细胞瘤中的异常表达有14例, 占77.7%, 其中7例有非时相表达Cyclin B1阳性率在星形细胞瘤复发前后有显著性差异 (P<0.01) ;另外实验中我们还发现复发星形细胞瘤中有较多的异倍体细胞。
3 讨论
肿瘤最基本的特征是细胞的失控性生长, 因此可以说肿瘤的发生发展与细胞周期的破坏密切相关。而细胞周期调控机制的核心是Cylins的时相性表达, 正是由于这种高度保守的蛋白质所具备的时相性表达特点, 才使细胞周期蛋白依赖激酶 (CDK) 得以顺序激活, 激活的CDKs作用于一系列底物使细胞周期在精确的调控下正常进行。细胞周期不同时相之间存在着关键的调控点, 包括控制进入S朗的调控点 (G1/S期调控点) 和控制进入M期的调控点 (G2/M期调控点) , 它是细胞唯一能从外界接受增殖信号或抑制信号的时期。G2期存在一个检测点 (check point) , Cyclin A具有调节DNA合成和促进细胞进入分裂期的双重作用。Cyclin B1在S期开始表达, 在G2M时达到峰值, 到有丝分裂中期向后期转换时消失。Cyclin B1一直被认为在G2/M期对细胞分裂的调控起关键作用, 星形细胞瘤是颅内最常见的肿瘤, 其生长呈侵润性, 边界不清楚, 术后易复发, 且复发时恶性程度往往增加。大量研究显示在乳腺癌、食管癌、肝细胞癌、结直肠癌、肺癌等中均发现有Cyclin A和Cyclin B1扩增和过度表达。现在多数学者赞同星形细胞瘤存在cyclin A和Cyclin B1过表达和基因扩增, 且其程度与肿瘤分级和预后相关[4~6]。我们经FCM检测的正常脑组织中Cyclin A和Cyclin B1表达含量和时相均正常, 而在原发星形细胞瘤中, Cyclin A有36.8%的阳性表达, 在复发发星形细胞瘤中有83.3%的阳性表达, 存在显著性差异 (P<0.01) 。在原发星形细胞瘤中, Cyclin B1有27.8%的阳性表达, 在复发发星形细胞瘤中有50%的阳性表达, 存在显著性差异 (P<0.01) 。提示Cyclin A和Cyclin B1在星形细胞瘤发生、发展过程中的重要分子事件之一, 可以作为星形细胞瘤预后复发的重要参考指标。
实验中我们还发现在星形细胞瘤中cyclin A和Cyclin B1非时相性表达, 且复发后Cyclins蛋白表达的非时相性更加明显, Hulsebos[7]等对胶质瘤的多种细胞周期调控因子进行了定量分析, 结果显示将星形细胞瘤细胞用洛伐他汀同步化后细胞周期分析发现存在Cyclin B1的非时相性表达, 其意义尚不十分明了。我们认为Cyclin A和Cyclin B1蛋白表达的非时相性在肿瘤的恶性进展中起重要的作用。这种非时相性表达的Cyclin A和Cyclin B1蛋白可能有几个原因引起: (1) Cyclins蛋白的降解过程受到破坏。 (2) 可能是某种Cyclins蛋白的抑制因子受到破坏。目前已证实星形细胞瘤中有P53, P21等抑制因子的异常改变。Stallings等[8]研究表明在病理级别增加的复发胶质瘤复发前后有TP53基因变异的不同。非时相性表达的Cylins蛋白会影响细胞周期的正常调控, 从而导致肿瘤的发生发展。Cyclin A和Cyclin B1非时相性表达在星形细胞瘤复发中的意义还不清楚, 实验中我们还发现复发星形细胞瘤中有较多的异倍体细胞, 推测Cyclin A和Cyclin B1表达时相的延迟可以损害M期的进程, 导致多倍体, 异倍体细胞的形成[9]。
目前研究显示Cyclin B1是一种肿瘤抗原, 我们在实验中发现Cyclin B1的高表达往往伴有细胞凋亡, 其机制可能为肿瘤的免疫效应。同时我们认为可以利用Cyclin是一种较为保守的蛋白的特性, 研制肿瘤疫苗, 为肿瘤的治疗提供一种新的方法。
本研究通过Cyclin A和Cyclin B1在复发星形细胞瘤中的表达, 证实了Cyclin A和Cyclin B1蛋白与星形细胞瘤的恶性进程和复发密切相关, 同时Cyclin A和Cyclin B1蛋白可作为判断肿瘤复发有意义的预后指标, 深入研究不仅有助于揭示星形细胞瘤的发生发展机制, 并可为肿瘤的防治提供一个新的视点。
摘要：目的 研究CyclinA, CyclinB1蛋白在星形细胞瘤复发前后中的表达水平及其对预后的作用。方法 应用流式细胞术的DNA/Cyclin双参数分析法检测星形细胞瘤复发前后的CyclinA, CyclinB1蛋白的表达。结果 CyclinA在原发星形细胞瘤中的异常表达有7例, 占38.8%, 在复发星形细胞瘤中的异常表达有15例, 占83.3%, 其差异有显著意义 (P<0.01) ;CyclinB1在原发星形细胞瘤中的异常表达有6例, 占33.3%, 在复发星形细胞瘤中的异常表达有14例, 占77.7%, 其差异有显著意义 (P<0.01) 。同时发现在星形细胞瘤复发前后有CyclinA, CyclinB1的非时相表达。结论 CyclinA与CyclinB1的表达水平与星形细胞瘤的恶性程度呈正相关, CyclinA, CyclinB1可以更好的评价星形细胞瘤患者的预后。
关键词：CyclinA, CyclinB1,星形细胞瘤,复发,流式细胞术,非时相表达
参考文献
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