引言
芦丁是黄酮类化合物的典型代表, 广泛存在于自然界, 在植物的根、茎、叶、花、果实、种子中都有存在。一些常用中药 (如大枣、山楂、银杏、枸杞、益母草、柴胡、夏枯草、芦荟、绞股蓝等) 都含有芦丁。目前, 我国芦丁生产主要以槐米为原料进行提取。槐米具有止血, 降压, 抗炎, 保护心血管, 抗血小板凝集, 抗病毒, 抗癌防癌, 抑制脑梗塞, 抗肝损伤及抗辐射损伤等药理作用[1,2]。其中, 防癌抗癌、保护心血管、护肝、抗辐射等作用都归因于芦丁的抗氧化作用。目前芦丁已做成药物并在临床上应用的有:芦丁的衍生物三羟乙基芸香甙 (troxerutin) , 即维脑路通, 用于治疗烧伤、关节炎及各种血管疾病;芸香甙胶囊, 治疗内、外痔患者, 疗效显著;中华薄荷王是以芦丁作紫外光吸收剂的一种天然防晒剂等。芦丁具有保护血管和心肌, 降低甘油三酯, 清除活性氧, 抗氧化等多种药理作用[3,4]。国内外对芦丁的清除自由基作用研究较多:芦丁具有较强的清除DPPH[5], 羟自由基[6], 氧负离子[6]的能力。相对而言, 芦丁清除自由基的机理的研究较少[7], 张红雨等[8]推测黄酮类化合物 (以芸香甙为例) 清除O2·-是通过以下反应 (1) 完成的:
到目前为止, 关于芦丁清除自由基动力学方面的研究尚未见任何文献报道。本实验首次从物理化学的角度研究了芦丁抗氧化反应级数和反应活化能, 为探索芦丁的抗氧化机制提供了进一步的科学依据。
1 实验材料
1.1 主要试剂
邻苯三酚, 三羟甲基氨基甲烷 (Tris) , 冰乙酸, 无水乙醇, H2O2, Fe SO4·7H2O, HCl, 水杨酸, 硫代硫酸钠, 碘化钾, Na OH, 柠檬酸, 磷酸, 均为分析纯, 成都市科龙化工试剂厂;甲醇, 色谱纯, 天津市科密欧化学试剂有限公司;三蒸水 (溶剂均经纯化充氮保存) 。
1.2 主要仪器
SBD50恒温水浴锅, 丹麦Heto-Holten公司;U-1800紫外分光光度计, 日本HITACH仪器公司;高效液相色谱仪, 日本岛津公司SHIMADZU;检测器, SPD-M20A。
2 实验方法
2.1 芦丁对超氧自由基O2·-的清除能力试验
采用邻苯三酚自氧化法[9]。在试管中加入50mmol/L的Tris-HCl缓冲液 (p H8.2) 2m L, 再加入1m L不同浓度 (0.01, 0.03, 0.05, 0.08, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5) mg/m L的芦丁, 于25℃保温20min, 取出后立即加入25℃预温的3mmol/L的邻苯三酚0.3m L, 总体积3.3m L, 迅速摇匀, 倒入1cm比色杯中, 在25℃恒温条件下测定325nm处的比色值, 每隔0.5min测一次吸光值。以0.3m L, 10mmol/L的盐酸代替邻苯三酚作为待测溶液的本底吸收值。每一吸光值平行测3次, 取其平均值。对O2-的清除率可表示为:
清除率 (%) = (A0- (AX-AX0) ) /A0×100%
其中:A0为空白对照液的吸光度;
AX为加入待测溶液后的吸光度;
AX0为待测溶液的本底吸收值。
2.2 HPLC法测定芦丁对O2·-的清除能力
2.2.1 色谱条件
Hypersil BDS C18, 5μm (4.6mm×200mm) 色谱柱, 以甲醇:水:冰乙酸 (40:59:1) 为流动相;检测波长254nm;流速为1.0m L/min, 柱温30±1.0℃。
2.2.2 样品测定
分别向6只试管中加入1m L浓度为0.1mg/m L的芦丁, 再加入3m L的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液, 然后加入1m L浓度为60mmol/L的邻苯三酚, 在15℃下分别水浴0.5min, 1min, 2min, 4min, 6min, 10min, 然后用滴管滴入一滴3mol/L的盐酸 (约0.01m L) 终止反应, 然后用20u L微量进样器进样, 记录色谱图, 测定峰面积;方法同上另一组在25℃下终止反应。对照组有: (1) 50mmol/L的Tris-HCl缓冲液; (2) 60mmol/L的邻苯三酚; (3) 1m L 60mmol/L的邻苯三酚在3m L PH值为8.2的TrisHCl缓冲液反应完全; (4) 0.1mg/m L的芦丁, 色谱图见图1。
2.3 芦丁及其氧化产物的摩尔吸光系数确定
配制0.1mg/m L (1.64×10-4mol/L) 的芦丁溶液, 在1厘米比色杯中, 于254nm条件下测定芦丁的吸光度, 用于计算芦丁的吸光度值。
根据反应方程式 (1) , 1 mol的芦丁 (1) 反应后将变为1mol的氧化产物 (2) , 即当芦丁反应一半时, 芦丁氧化产物将生产相同的量。根据图1的浓度, 可以计算出芦丁和芦丁氧化产物的浓度相同时, 他们在254nm下的吸光度比 (HPLC图谱中相应峰面积比) ;最后, 根据芦丁的吸光度系数, 即可推算出芦丁氧化产物的吸光度系数。
3 实验结果与讨论
3.1 芦丁超氧自由基 (O2·-) 清除能力测定结果
芦丁对超氧自由基 (O2·-) 的清除能力随着浓度的增加而增加, 清除率与浓度关系曲线见图2。
经回归分析, 芦丁的清除O2-·能力与浓度成对数关系, 回归方程为:
浓度范围0.01mg/m L~0.10mg/m L, R2=0.9864, IC50=0.0253mg/m L。
3.2 芦丁及其氧化产物的吸光度系数
试验测得1.64×10-4mol/L的芦丁在254nm处的吸光度为2.268。
式中:A-吸收度;
L-液层厚度;
C-溶液的摩尔浓度。
根据 (2) 式, 可以计算芦丁的摩尔吸光系数:
当芦丁反应量达到50%时, 根据图1可以计算出:
据此, 可以推算出芦丁氧化产物 (2) 的摩尔吸光度系数为:ε1cm254nm=2.49×105。
3.3 反应级数和表观速率常数
试验测得15℃和25℃下, 反应体系中芦丁浓度的变化如图3。从图中可以看到, 随着时间的增加, 芦丁的浓度单调下降。
反应 (Ⅰ) 中, 由于邻苯三酚的浓度 (60mmol/L) 远远大于芦丁的浓度 (0.164mmol/L) , O2·-由邻苯三酚产生, 因而可以认为O2·-的浓度远大于芦丁的浓度, 此时可将O2·-的浓度视为常数, 所以该反应微分速率方程具有如下的简单形式:
式中:VA为氧化反应的速度;
CA为芦丁的浓度;
t为反应时间;
kA为反应速度常数;
n为反应级数。
对图3进行二项式拟合, 可以得到:
根据 (6) 和 (7) 式, 对时间求导, 即可得到某一时间 (t) 时浓度对时间的导数d C/dt。以ln (-d C/dt) 对ln CA作图, 可以得到图4。
从图4中可以看到, 他们有较好的线性关系, 而且二者的斜率基本相同。对直线进行拟合, 可以得到:
根据 (8) 和 (9) 式, 该直线的斜率即为反应级数, 曲线截距即为该反应表观速度常数的对数。
对图4进行回归分析:-ln (-dc/dt) 与-lnc A成直线关系, 直线方程对应如下:
(10) 和 (11) 式斜率的平均值即为该反应级数的平均值:n=3.6101。
由直线截距计算得该反应的表观速率常数为:
根据阿仑尼乌斯公式[10]:
取对数并变换方程式, 可以得到:
根据 (13) 式计算得到芦丁抗氧自由基的反应活化能为:Ea=11.76k J/mol。
4 小结
应用紫外分光光度计和HPLC, 详细研究了芦丁体外清除氧自由基的反应动力学, 测定了其动力学常数:反应级数平均值n=3.6101, 在15℃和25℃条件下表观速率常数分别为K15℃=5.53×1010mol-2.61·l2.61·min-1;K25℃=6.52×1010mol-2.61·l2.61·min-1, 表观活化能Ea=11.76k J/mol, 初步确定了动力学模型
摘要：为确定芦丁体外清除超氧自由基 (O2·-) 的动力学模型, 应用紫外可见吸收光谱和高效液相色谱, 采用邻苯三酚自氧化法, 得出芦丁氧化产物的吸光度系数ε254nm1cm=2.49×105, 反应级数平均值n=3.6101, 表观活化能Ea=11.76kJ/mol, 初步确定了动力学常数。
关键词：超氧自由基,紫外可见吸收光谱,HPLC,吸光度,反应级数,动力学
参考文献
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