近年来, 聚合物胶束作为一种新型的药物载体, 受到越来越多的关注。由于聚合物胶束具体独特的壳-核结构, 疏水的内核, 可以包载难溶性药物, 改善药物的溶解性能[1,2];其亲水性外壳可躲避其被网状内皮系统 (RES) 识别, 易于实现长循环。壳聚糖具有良好的生物相容性和生物可降解性, 利用其葡萄糖单元上的氨基和羟基反应的活性, 通过接枝亲水或疏水基团, 获得两亲性壳聚糖衍生物, 作为聚合物胶束的载体材料, 是目前靶向药物传递载体的研究热点之一[3]。
羟基喜树碱是从喜树中分离出来的一种吲哚类生物碱, 抗瘤谱广, 对腹水型肝癌、头颈部肿瘤、胃癌及白血病等均有一定疗效[4]。由于羟基喜树碱难溶于水, 目前国内上市的制剂是在碱性溶液中使羟基喜树内酯环开环后形成的水溶性羧酸盐, 导致该制剂疗效较低, 且毒副作用严重, 从而影响其广泛应用。本文以半乳糖化十六酰壳聚糖为聚合物胶束载体材料, 采用乳化溶剂挥发法制备包载羟基喜树碱的聚合物胶束, 通过考察制备工艺对药物包封率的影响, 获得最佳的载药聚合物胶束。有望发展成为改善羟基喜树碱的溶解性, 并提高疗效和降低毒副作用的新型纳米给药系统。
1 仪器与试药
1.1 仪器
RF-5301型荧光分光光度计 (日本岛津公司) ;Scientz-IID超声波细胞粉碎机 (宁波新芝生物科技股份有限公司) ;752N型紫外可见分光光度计 (上海菁华科技仪器有限公司) ;JEM-1400型透射电子显微镜 (日本电子公司) ;Nano-ZS90型粒度检测仪 (英国M A L V E R N仪器有限公司) ;T G L-2 0 B型高速台式离心机 (上海安亭科学仪器厂) ;LGJ-18A型冷冻干燥机 (北京四环科学仪器厂有限公司)
1.2 药品与试剂
半乳糖化十六酰壳聚糖 (自制) ;羟基喜树碱 (成都兰贝植化科技有限公司) ;羟基喜树碱对照品 (中国药品生物制品检定所, 批号100526-200301) ;芘 (98%, 上海晶纯试剂有限公司) ;蒸馏水为重蒸水;其它试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 临界胶束浓度 (CMC) 测定
采用稳态荧光探针法测定临界胶束浓度。具体操作如下:称取0.025g半乳糖化十六酰壳聚糖溶于5ml氯仿中, 磁力搅拌下缓慢滴加入80ml重蒸水中, 然后在37℃旋转蒸发除去氯仿, 得淡蓝色乳光液体, 将液体转移至100ml容量瓶中, 重蒸水加至刻度, 摇匀, 得浓度为25×10-1mg/ml的样品溶液。另称取0.003g芘于100ml容量瓶中, 加适量丙酮溶解, 再加丙酮至刻度, 摇匀, 分别移取0.1ml该溶液于若干25ml容量瓶中, 用氮气挥干丙酮。分别加入不同体积的样品溶液, 以重蒸水定容至25ml, 得浓度为4×10-8mg/ml~25×10-2mg/ml的溶液。然后, 在室温下超声30min, 再于60℃水浴上加热3h, 之后室温放置过夜使芘和胶束溶液充分平衡。在激发波长为343nm, 发射波长为360nm~500nm, 激发和发射狭缝宽度分别为10nm和3nm的条件下, 测定芘的荧光强度, 根据芘在373nm和384nm处的荧光强度比值变化计算C M C值。
2.2 载药胶束HCPT-GHCM的制备
采用乳化溶剂挥发法[5], 取半乳糖化十六酰壳聚糖溶于5ml氯仿, 加入一定量羟基喜树碱, 加2ml乙醇, 使药物和载体材料完全溶解。磁力搅拌下, 用注射器将该溶液缓慢滴加入一定量的重蒸水中, 超声一定时间, 然后蒸发除去有机溶剂, 0.8μm微孔滤膜过滤, 得载药聚合物胶束, 冷冻干燥后备用。
2.3 制备工艺对包封率的影响
根据预实验中单因素考察的结果, 选择药物/载体比例、油/水相体积比、超声时间为考察因素, 每个因素3个水平, 采用L9 (34) 表, 进行正交试验, 以包封率为评价指标, 优化载药胶束的最佳制备工艺条件。正交试验因素水平表见表1, 正交试验方案见表2。
2.4 载药胶束的包封率及载药量测定
(1) UV测定波长的选择。称取适量羟基喜树碱对照品溶于甲醇制备对照品溶液。另称取适量空白胶束, 加三氯甲烷-甲醇 (4∶1) 破坏后, 再加甲醇使完全溶解, 得空白对照液。将对照品溶液和空白对照液分别在200nm~400nm扫描。HCPT在266nm处有最大吸收, 而空白对照液在此波长处无吸收, 因此选择测定波长为266nm。
(2) 标准曲线的建立。精密称取4 m g HCPT对照品, 置于100ml容量瓶中, 用甲醇溶解并定容至100ml, 摇匀, 分别移取不同体积于的该溶液于10ml容量瓶中, 用甲醇定容至10ml, 摇匀, 得浓度为0.4、2、4、6、8、12、16μg/ml的溶液, 在266nm处测定吸光度, 以吸光度A对浓度C进行回归, 得标准曲线方程为A=0.0 5 1 7 C+0.0 0 7 3 (r=0.9996) , 表明HCPT在0.4~16μg/ml范围内线性关系良好。
(3) 样品含量测定。精密称取一定量的载药胶束, 加1.25ml三氯甲烷-甲醇 (4∶1) 破坏胶束并完全溶解药物后, 转移至10ml容量瓶中, 加甲醇定容至10ml, 振荡混匀, 用0.45um微孔滤膜过滤, 滤液在266nm处测定吸光度, 计算载药胶束中羟基喜树碱的含量, 再按下式计算包封率和载药量。
2.5 HCPT-GHCM的形态、粒径及Zeta电位测定
取适量H C P T-G H C M, 采用磷钨酸负染法, 以透射电镜观察载药胶束的形态。用激光粒度仪测定粒径及Zeta电位。
3 结果与讨论
3.1 聚合物胶束的CMC
以373nm和384nm处的荧光强度之比 (I373/I384) , 对半乳糖化十六酰壳聚糖溶液浓度的对数 (logC) 作图, 由图中的拐点可得C M C, 见图1。
由于在壳聚糖上引入了十六酰基, 使半乳糖化十六酰壳聚糖具有两亲性, 可形成聚合物胶束。稳态荧光探针法, 以脂溶性的芘为荧光探针, 两亲性聚合物溶液浓度较低时, 微量的芘溶于极性的水中, 当两亲性聚合物浓度达到或高于CMC时, 胶束开始形成, 芘转移至胶束的疏水性内核中, 使荧光强度增强。由两条直线的交点算出半乳糖化十六酰壳聚糖的临界胶束浓度为8.6μg/ml。其CMC值显著低于小分子表面活性剂的C M C, 较低的C M C值, 表明胶束具有很好的热力学稳定性和抗稀释性, 即使被稀释到很低浓度依然能够维持其胶束结构。
3.2 载药胶束HCPT-GHCM的制备
根据载体材料的性质采用乳化溶剂挥发法制备载药聚合物胶束, 由于羟基喜树碱在氯仿和乙醇的混合溶剂中溶解性较好。先将GHC和HCPT溶解于氯仿-乙醇的混合溶剂中, 再于搅拌下滴入水中, 亲水性链段形成胶束的外壳, 疏水性的链段通过疏水作用、静电作用和氢键等分子间作用力相互聚集在一起, 形成胶束的内核[6], 疏水性药物也因为这些分子间作用在胶束形成过程中被包埋在胶束的内核中。
3.3 制备工艺对包封率的影响
药物/载体比例、油/水相体积比和超声时间对载药胶束包封率影响的正交试验结果见表2。
根据极差分析, 由表2可知, 3个因素对包封率影响大小的顺序为C>A>B, 即超声时间对胶束的包封率影响最大, 其次药物/载体比例, 再其次是油/水相体积比。最佳条件为A 2 B 2 C 3, 即H C P T/G H C的质量比为0.2∶1、油/水相体积比为1∶7、超声时间为40min。该条件制备的载药聚合物胶束包封率可达75.96%。
3.4 HCPT-GHCM的形态、粒径及Zeta电位
图2为按上述最佳条件制备的载药聚合物胶束的透射电镜图, 从图中可以看出, H C P T-G H C M呈球形, 具有明显的壳核结构, 大小较均一。激光测粒仪测得HCPT载药胶束的粒径在250nm～300nm之间, Zeta电位在10mV左右。载药胶束带有一定电荷, 使其在溶液中不易发生聚集, 具有一定的稳定性。
本文以自制的半乳糖十六酰壳聚糖做为载体材料, 采用乳化溶剂挥发法制备载药聚合物胶束, 透射电镜观察聚合物胶束呈球形, 且具有明显的壳核结构, 粒径在250nm~300nm之间。通过正交试验优化制备条件, 获得的载药胶束包封率可达75.96%, 表明此聚合物胶束对羟基喜树碱有较好的增溶效果。
摘要：制备羟基喜树碱半乳糖化十六酰壳聚糖胶束 (HCPT-GHCM) , 并考察其包封情况。方法:以半乳糖化十六酰壳聚糖 (GHC) 为载体材料, 采用乳化溶剂挥发法制备羟基喜树碱聚合物胶束, 应用正交试验考察药物/载体比例、油/水相体积比、超声时间对载药聚合物胶束包封率的影响并进行优化。结果:超声时间对胶束的包封率影响最大, 其次依次为药物/载体比例和油/水相体积比。最佳条件为:药物/载体比例0.2∶1, 油/水相体积比1∶7, 超声时间40min。制备的载药胶束粒径为250nm～300nm, zeta电位约为10mV, 包封率为75.96%。结论:所制备的HCPT-GHCM包封率较高, 粒径分布均匀, 对羟基喜树碱有增溶效果。
关键词：聚合物胶束,半乳糖化十六酰壳聚糖,羟基喜树碱
参考文献
[1] Zhang C, Qu G, Sun Y, et al.Pharmacokinetics, biodistribution, ef-ficacy and safety of N-octyl-O-sul-fate chitosan micelles loaded withpaclitaxel[J].Biomaterials, 2008, 29:1233～1241.
[2] 许向阳, 周建平, 李玲, 等.阿霉素高聚物胶束的制备及其体外抗肿瘤活性研究[J].中国药学杂志, 2008, 43 (7) :514～518.
[3] Ngimhuang J, Furukawa J, Satoh T, et al.Synthesis of a novel polymericsurfactant by reductive N-alkylationof chitosan with 3-O-dodecyl-d-glu-cose[J].Polymer, 2004, 45 (3) :837～841.
[4] 刘卫晶, 赵永星, 华海婴, 等.羟基喜树碱长循环亚微乳的制备及其在大鼠体内的药动学[J].中国医药工业杂志, 2010, 41 (6) :430～433.
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[6] 张琰, 汪长春, 杨武力, 等.聚合物胶束作为药物载体的研究进展[J].高分子通报, 2005, 2:42～46.