1 研究目的
T淋巴细胞亚群计数、NK细胞计数对于对评定运动员细胞免疫机能有一定作用,一般采用流式细胞仪进行检测。用流式细胞仪进行检测时,根据细胞上的特异抗原CD分子(如CD3阳性即总T细胞、CD3/CD4双阳性即辅助性T细胞、CD3/CD8双阳性即抑制性T细胞、CD3阴性且CD16/CD56双阳性即NK细胞)不同,而需采用特异性荧光标记抗体。目前,有一种新推出的Biolegend的CD3-P E Cy5/C D4-P E/CD 8-F ITC鸡尾酒抗体和CD 3-F IT C(CD16+CD56)-PE鸡尾酒抗体,和传统抗体相比虽标记顺序略有差异但使用荧光相同且更经济。但在流式细胞仪上是否适用这种新抗体检测T细胞亚群和NK细胞,并未见有报道。
本研究的目的是在流式细胞仪上用此新抗体检测运动员T细胞亚群和NK细胞并和传统抗体进行比较,确定2种抗体的分析检测结果是否具有差异和可比性,从而明确在流式细胞仪上是否适用这种新抗体检测T细胞亚群和NK细胞。
2 对象与方法
2.1 研究对象
运动员男21人,年龄(17±1.20)岁,身高(176±4.28)cm,体重(71±5.10)kg,专项训练年限(3±1.19)年。女29人,年龄(18±2.40)岁,身高(166.5±2.69)cm,体重(61.4±4.98)kg,专项训练年限(2.4±1.25)年。
2.2 测试方法
2.2.1 仪器
贝克曼EPICS XL型流式细胞仪,白杨BFX5-320低速离心机,VORTEX涡旋混合器。
2.2.2 试剂
(1)荧光抗体:Coulter的抗人的CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE Cy5三标抗体,同型对照鼠抗人IgG 1-FITC IgG 1-PE/IgG 1-PE Cy5抗体;Coulter的抗人的CD3-FITC/(CD16+CD56)-PE双标抗体,同型对照鼠抗人IgG 1-FITC/IgG1-PE抗体;Biolegend的抗人CD3-PE Cy5/CD4-PE/CD8-FITC Cocktail抗体,同型对照IgG 1-PE Cy5/IgG 1-PE/IgG 1-FITC抗体;Biolegend的抗人CD3-FITC/(CD16+CD56)-PE Cocktail抗体,同型对照IgG 1-FITC/IgG 2a-PE抗体;(2)其他试剂:Flow Check质控品,OptiLyse C溶血剂,15%EDTAK2溶液,1×PBS缓冲液,抗凝剂取5ul置于1.5mL离心管中。
2.2.3 血样采集
分3～4次,采集50例(男21例,女29例)运动员静脉血1mL;混匀。白细胞计数控制在5～10×109/L,全血采集后6小时内制备。
2.2.4 样本编号
(1)流式细胞仪上2种抗体检测T细胞亚群:每份血样制备4份,阴性对照管编号C1～N,用Coulter抗体标记的记做C_C1～N,用Biolegend抗体标记的记做B_C1～N。阳性测试管编号T1～N,用Coulter抗体标记的记做C_T1～N,用Biolegend抗体标记的记做B_T1～N。(2)流式细胞仪上2种抗体检测NK细胞每份血样制备4份,阴性对照管编号D1～N,用Coulter抗体标记的记做C_D1～N,用Biolegend抗体标记的记做B_D1～N。阳性测试管编号N1～N,用Coulter抗体标记的记做C_N1～N,用Biolegend抗体标记的记做B_N1～N。
2.2.5 测试方法
(1)100uL全血加入20uL阴性对照或荧光抗体混匀,25℃避光存放20min;(2)加入500uL溶血剂,25℃混匀避光存放10min;(3)加入500uL1×PBS缓冲液,25℃混匀避存放10min;(4)1500rpm,离心5min;(5)弃上清液,加入1mL1×PBS缓冲液;(6)上机分析。分析方案,FITC-FL1通道/PE-FL2通道/PE Cy5-FL4通道,进行T细胞亚群计数。FITC-FL1通道/PE-FL2通道,进行NK细胞计数。阴性对照要求FL1/FL2/FL4通道计数<2%。(7)分析指标:T细胞亚群(T3、T4、T8百分比、T4/T8比值)、NK细胞(T3、NK百分比)。
2.3 统计方法
用SPSS统计软件进行配对t检验。
3 结果
3.1 流式细胞仪上2种荧光抗体检测T细胞亚群的比较结果(表1)
表1显示,流式细胞仪上2种荧光抗体检测T细胞亚群,T3、T4、T8百分比、T4/T8比值等指标无显著性差异。
3.2 流式细胞仪上2种荧光抗体检测NK细胞比较结果(表2)
表2显示,流式细胞仪上2种荧光抗体检测NK细胞,T3、NK百分比等指标无显著性差异。
4 讨论
血液中T淋巴细胞亚群和NK细胞的检测是观察机体细胞免疫水平的重要方法。体育科研中也常检测外周血中T细胞亚群(CD3/4/8)和NK细胞(CD3/16/56)检测,并结合其他指标对于分析运动员的细胞免疫状况,进行运动员机能评定可以提供相当佐证。我中心运动病理实验室的贝克曼EPICS XL流式细胞仪进行T细胞亚群和NK细胞检测时,原使用Coulter抗体。如抗人的CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE Cy5三标抗体及其同型对照用于检测T细胞亚群,抗人的CD3-FITC/(CD16+CD56)-PE双标抗体及其同型对照用于检测NK细胞。但在使用上述抗体时,我们发现并和同行交流后提出如下问题:
(1)原抗体实际使用过程中预处理时间较长,步骤繁琐,平均一个样本的预处理时间需要30min左右,如再加上阴性对照和上机分析的时间就非常耗时耗力,这常是制约大通道、快速检测样本的瓶颈。因此,寻找其他便捷、可替代的抗体标记方法和样本预处理方法,缩短检测时间就是我们必须考虑的任务之一。
(2)原抗体的成本较高。如这2种抗体的包装规格仅都是50Test/每瓶,不计其他耗才的情况下,每一个样本上述2种指标的检测成本都十分惊人。同样在临床上,这种检测也是相对昂贵的收费项目,但通过相对大的测试样本数仍可较好维持此项检测。但对于体育科研而言,检测样本无法与临床相比,因此社会效益就是我们必须考虑的任务之二。
(3)有报道的自制试剂或国产试剂由于多为单标抗体,不仅没有简化标本预处理步骤,反而增加了荧光抗体的互相干扰而检测结果差强人意。
最近一种新推出的Biolegend的CD3-PE Cy5/CD4-PE/CD8-FITC鸡尾酒抗体和CD3-FITC/(CD16+CD56)-PE鸡尾酒抗体和原抗体比较虽抗原标记荧光顺序略有差异但有如下特点,可一定程度上解决上述矛盾。
(1)标记荧光与原抗体完全一致保证了在流式细胞仪上使用的通用性和替换可能,而且是三标或双表抗体这一良好特性保证了预处理的简易性。
(2)新抗体具有更佳的性价比,而且临床实验室也已开始大量使用。
(3)在流式细胞仪上用这2种抗体检测T细胞亚群和NK细胞并进行比较,还未见报道。(1)临床上由于前述测试样本相对较大,基本不存在成本压力问题;(2)基础科研上多用单标抗体进行肿瘤标记物检测,开展正常人(如运动员机能评定)T细胞亚群和NK细胞的三标或双标荧光抗体法检测并不多见。因此,本研究不仅具有非常大的实际测试和工作必要性,而且有一定社会效益。
本研究的实验结果显示,流式细胞仪上2种荧光抗体检测T细胞亚群、NK细胞,T3、T4、T8、NK百分比、T4/T8比值等指标无显著性差异(P>0.05),结果具有高度可比性。Biolegend新抗体高度适用于流式细胞仪上检测运动员T细胞亚群、NK细胞,而且长期使用更经济,建议作为首选标记抗体。
摘要：目的 通过用2种不同免疫荧光抗体标记运动员T细胞亚群和NK细胞,在流式细胞仪上测定并进行结果比较。方法 采集50例运动员静脉血,分别用Coulter原抗体和Biolegend新抗体标记T细胞亚群和NK细胞,在流式细胞仪上检测T细胞(T3)、辅助性T细胞(T4)、抑制性T细胞(T8)、NK细胞(百分比)等指标,比较测试结果的差异。结果 用2种荧光抗体检测运动员上述指标无统计学差异(P>0.05),结果具有高度可比性。结论 Biolegend新抗体高度适用于流式细胞仪上检测运动员T细胞亚群、NK细胞检测,而且长期使用更经济,建议作为首选标记抗体。
关键词：免疫荧光,抗体,T细胞,NK细胞,流式细胞术
参考文献
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