纤维素水解范文第1篇
1 有机磷水解酶的表面展示研究
1.1 有机磷水解酶表面展示技术
细胞表面展示系统包含3个基本的元件:宿主菌、乘客蛋白、运载蛋白, 其中宿主菌主要作为乘客蛋白和运载蛋白结合的载体, 乘客蛋白是要展示到细胞表面的目的蛋白, 运载蛋白主要是与乘客蛋白相结合, 并将目的蛋白运送到细胞表面实现固定。细胞表面展示的过程实质是蛋白质跨膜转运的过程, 其中涉及到不同蛋白质分泌转运。据报道, 有机磷水解酶已经成功地展示到大肠杆菌、假单胞菌、酵母菌以及某些藻类中, 并且展示到细胞表面的有机磷水解酶有较高的生物活性[2]。
1.2 大肠杆菌表面展示有机磷水解酶
大肠杆菌因细胞结构较简单, 遗传背景被研究得较为透彻。因此, 常作为工程菌在研究中使用, 大肠杆菌不仅可以高效地表达外源蛋白质, 而且也成为最常用的细胞表面展示系统。
黎小军等从黄杆菌ATCC27551中克隆出有机磷水解酶基因opd, 并将其直接与XcmⅠ酶切去除Ampr抗性基因片段的p ZXL-T载体相连, 这样opd基因被成功克隆于锚定单元Lpp-Omp A编码序列下游, 最后转化至大肠杆菌BL21 (DE3) , 经检测发现, 重组的大肠杆菌能表达产生51 k Da的融合蛋白, 而且还具有全细胞生物活性。在以对氧磷为底物的酶活检测实验中, 其酶活 (酶活力单位定义为:每分钟水解1μmol对氧磷所需酶量) 达到0.018 U/OD600, 而作为对照的空宿主菌没有检测出有机磷水解酶活性[3]。
1.3 酵母菌表面展示有机磷水解酶
在众多的微生物表面展示系统中, 酿酒酵母表面展示系统对蛋白的装配有严格的调控, 并且可以对展示的蛋白质进行一些修饰, 这样展示的蛋白质就具有更多的生物活性。同其他展示系统相比, 其表面展示蛋白质分子量更大。因此, 酵母表面展示系统也越来越广泛地被应用。
Takeshi Fukuda等利用Flo1p锚定单元, 构建了Flo1p-OPH重组质粒, 成功地将有机磷水解酶展示到酵母表面。以对氧磷为底物, 重组菌的酶活 (酶活力单位定义为:每毫克细胞干重每分钟生成1 nmol对硝基苯酚所需的酶量) 达到2000 U/ (mg细胞干重) , 这比之前报道的用GPI锚定单元, 展示有机磷水解酶的全细胞生物酶催化活性高8倍[4]。因此, Flo1p锚定单元可以很好地用于有机磷水解酶表面展示。Xing-Xing Wang等以冰核蛋白N端序列作为锚定位点, 将甲基对硫磷水解酶 (MPH) 展示到解脂耶氏酵母表面, 经检测发现, 其全细胞甲基对硫磷水解酶的活力 (酶活力单位定义为:在35℃时, 每分钟产生1μmol对硝基苯酚所需要的展示酶量) 为450.6 U/m L培养基, 重组菌的最适温度为40℃、最适p H为9.5, 当重组菌的OD600为2.6、甲基对硫磷的浓度为100 mg/L时, 在30 min以内大约有90.8%的甲基对硫磷被水解[5]。这表明重组菌全细胞生物催化活性很高。
1.4 假单胞菌表面展示有机磷水解酶
恶臭假单胞菌是一种革兰氏阴性菌, 其自身结构较简单, 遗传背景比较清楚, 全基因组测序已经完成。由于恶臭假单胞菌具有较强的抗逆性能, 能在极端环境条件下生长繁殖, 若在其表面展示有机磷水解酶, 那么重组菌就能更稳定、更长时间地处理有机磷农药废水[6]。
Yu l a n Yu a n等构建了具有绿色荧光蛋白、有机磷水解酶、冰核蛋白的融合载体 (INPNC-OPH-GFP) , 并将其展示到具有降解对硝基苯酚 (PNP) 能力的恶臭假单胞菌 (P.putida JS444) 细胞表面, 经检测发现, 展示到细胞表面的重组蛋白既没有抑制细胞的生长, 其本身的生物活性也几乎没有损失。在含有100 mg/kg对硫磷的培养基中培养重组工程菌, 不到15 d的时间, 对硫磷就被完全降解[7]。
2 展望
有机磷水解酶表面展示技术发展越来越迅速, 目前, 有报道称有机磷水解酶已经成功地展示到蓝藻细胞表面, 这种新的展示系统的发现, 为有机磷水解酶的应用提供了新的方向。由于将有机磷水解酶展示到细胞表面, 不仅克服了有机磷废水不能透过细胞膜等问题, 而且重组工程菌和废水的接触面积增大, 这样更有利于催化水解反应的进行, 大大提高降解的效率。现在, 因为重组菌具有全细胞生物催化活性, 而被广泛用于生物传感器, 用来检测废水中有机磷的浓度。但目前, 有机磷水解酶表面展示技术还存在着不足, 一些展示系统的遗传背景较复杂、性能不稳定, 因此, 展示的效率可能不高;另外, 由于展示的过程复杂, 成本高, 限制了有机磷水解酶表面展示的大规模应用。今后, 表面展示系统的开发将会是表面展示技术研究的重点。
摘要：近年来, 有机磷水解酶越来越多地被展示到不同的细胞表面。对有机磷水解酶的细胞表面展示技术的原理, 大肠杆菌、假单胞菌、酵母菌等几种细胞表面展示有机磷水解酶系统的研究概况进行综述。
关键词：有机磷废水,有机磷水解酶,细胞表面展示
参考文献
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[2] Sang Yup Lee, Jong Hyun Choi1, Zhaohui Xu.Microbial cell-surface display[J].TRENDS in Biotechnology, 2003, 21 (1) :45-52.
[3] 廖上铁, 黎小军.有机磷水解酶及其细胞表面展示研究进展[J].安徽农业科学, 2010, 38 (4) :2165-2167.
[4] Takeshi Fukuda, Kouta Tsuchiyama, Hirokazu Makishima, et al.Improvement in organophosphorus hydrolase activity of cell surface-engineered yeast strain using Flo1p anchor system[J].Biotechnol Lett, 2010 (32) :655-659.
[5] Xing-Xing Wang, Zhe Chi, Shao-Guo Ru, et al.Genetic surface-display of methyl parathion hydrolase on Yarrowia lipolytica for removal of methyl parathion in water[J].Biodegradation, 2012 (23) :763-774.
[6] 张红星, 李茜茜, 叶婷, 等.细胞表面展示有机磷水解酶的恶臭假单胞菌的构建及全细胞酶活性分析[J].华中农业大学学报, 2008, 27 (1) :65-70.