随着艾滋病流行形势的日趋严峻, 新发现的感染者数量不断增加, 艾滋病检测也显得越来越重要。目前国内艾滋病初筛试验室检测HIV抗体的方法主要是酶联免疫法 (ELISA) 。ELISA法是敏感性高、特异性强、重复性好的试验诊断方法, 其试剂具有稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素, 既适用于大规模筛查试验, 又可以使用于少量标本的检测等优点。但ELISA法的实验过程中有很多影响因素, 如何消除诸多影响因素, 保证检测结果的准确性, 笔者在实际工作中经长期观察总结, 对ELISA法检测HIV抗体影响因素分析如下。
1 试剂的准备
《全国艾滋病检测技术规范》 (2009版) 规定, HIV抗体检测试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准, 在有效期内的试剂, 其中酶联免疫试剂应批批检合格, 推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。ELISA多为单纯HIV抗体检测试剂, HIV抗原抗体联合检测试剂可同时检测血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体。HIV抗原或抗体被包于固相载体, 加入待检样品和酶标记的HIV抗原或抗体, 加底物显色, 用酶标仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。
对于试剂的稳定性、敏感性和特异性等指标, 由于基层实验室不能得到血清转化盘和大量的阳性标本, 不能进行自己测定, 只能看试剂厂家的批检报告和每年国家有关部门的临床评估报告, 所以在购买试剂时索取和审查厂家提供的批批检报告至关重要。在操作中, 试剂在测定前一定要在室温下恒温30min, 如果不经过恒温过程, 储存温度和室温的差异会使酶标板上凝集一些小水珠, 也使开始反应的温度不恒定, 影响到抗原抗体的结合与反应的速度, 未用完者需放入有干燥剂的密封袋中保存。在储存上, 一般在2～8℃, 特别注意试剂盒不能紧贴冰箱储存室后壁摆放, 否则试剂会被冰冻, 复融后试剂的总体效价将严重偏低, 不能使用。不同批号试剂组分不得混用, 过期的试剂一律不得使用, 否则检测结果不可信。
2 样品采集和处理
HIV抗体筛查可采用血清、血浆、滤纸干血斑、唾液和尿液样品。用于检测的标本应保持新鲜, 标本的采集应尽量避免溶血, 因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质, 干扰结果, 会出现假阳性;标本如果受细菌污染, 会因菌体中含有内源性过氧化物酶而出现假阳性;混浊或有沉淀的血清样品应离心, 待澄清后方可检测, 避免对结果造成影响。
用于HIV抗体检测的血清或血浆样品应存放于-20℃以下, 短期 (1周内) 进行检测的样品可存放于2～8℃。融解时应上下颠倒充分混匀, 动作要轻缓, 避免产生气泡。同时应注意避免样品反复冻融, 否则会造成样品抗体效价降低, 影响其结果, 甚至出现假阴性结果。
3 仪器和操作
3.1 加样
HIV抗体检测必须符合《全国艾滋病检测技术规范》, 严格防止交叉感染。操作时必须戴手套、穿工作衣, 严格执行消毒隔离制度。加样要用微量移液器 (要求准确性高并定期进行校正) , 按规定的量加入孔内, 避免加在孔壁的边缘, 垂直加样, 不要使吸头碰到酶标板孔上的已包被的抗原, 加样时尽量慢吸快放, 同时注意不要溅出, 避免产生气泡。每次加样都要更换吸头, 做到一样一吸头, 防止发生交叉污染, 干吸头预先在血清中抽吸3次, 以便保证加样量的准确性。滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第1滴后再进行滴加, 以免产生气泡。
3.2 温育
抗原抗体反应需要在一定的温度下 (最适温度为37℃) , 经过一定的时间才能达到反应的平衡点。温育一般采用能使反应液温度迅速达到平衡的水育法, 一种是放在水育箱的隔板上, 另一种是放在温箱的湿盒内, 水要浸至板条的1/3处, 不可将板条叠加放置, 以保证各板的温度平衡一致。
3.3 洗板
由于待检血清中可能有HIV病毒的存在, 采用ELISA法进行检测HIV抗体时, 尽量使用洗板机洗板, 一方面可以确保检测人员的安全, 另一方面可以防止环境污染。洗板在ELISA检测中是一个非常重要的环节, 洗板的合格与否直接影响检测结果的准确性。因此, 洗板时一定要先放好, 洗涤开始时注意观察洗板机上的每个吸液针是否都一致地插入孔底, 并且将孔内液体全部吸干, 按说明书要求设置浸泡的时间以及洗涤的次数。洗涤结束后进行拍板, 同时要用蒸馏水冲洗管道, 避免由于洗液的结晶而造成管道堵塞。同时要注意各种试剂盒的洗涤液不可混用。同时要注意: (1) 洗两个不同厂家的酶标板时, 应注意调整吸液头的下降高度, 以免因高度不适使冲洗针头卡住酶标板。 (2) 是当吸液针头有破损时, 应及时更换, 否则吸液端由平端变为尖锐, 板底包被破坏可能性增加, 对结果影响较大。 (3) 溢液的问题, 洗液不足洗不干净 (特别是边缘残留的酶标物) , 洗液太多容易溢出, 这就要求不断调整洗液量。
3.4 显色与观察结果
严格按照说明书规定的时间、温度恒定、反应后终止, 并在显色反应终止后立即用酶标仪进行比色。
4 讨论
ELISA法进行HIV抗体检测可用于诊断、血液筛查、监测等。以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况, 包括临床检测、自愿咨询检测、根据特殊需要进行的体检等。以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV, 包括献血员筛查和原料血浆筛查。以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势, 包括各类高危人群、重点人群和一般人群。根据检测目的选用符合要求的筛查试剂对样品进行初筛检测, 对呈阴性反应的样品, 可出具HIV抗体阴性 (-) 报告;对呈阳性反应的样品, 需要进一步做复检试验和确证试验。
复检试验应使用原有试剂和另外一种不同原理 (或厂家) 的试剂, 或另外两种不同原理或不同厂家的试剂进行复检试验。如果初筛检测使用抗原抗体联合试剂, 则复检必须包括一种抗原抗体联合试剂。如2种试剂复检均呈阴性反应, 则报告HIV抗体阴性如均呈阳性反应, 或一阴一阳, 需送艾滋病确证实验室进行确证试验。如果抗原抗体联合试剂检测呈阳性反应, 而抗体试剂检测为阴性反应, 则应考虑进行HIV-1P24抗原或核酸检测, 必要时进行随访。艾滋病检测筛查实验室复检判定为阳性反应的样品, 确证实验室可以直接进行确证试验。
总的来说, ELISA试剂发展已相对成熟, 是艾滋病初筛试验室检测HIV抗体普遍使用的方法, 只要选择灵敏度高、特异性好的试剂, 注意其中的诸多影响因素, 注意试剂的储存和仪器的保养, 在操作中严格按照试剂说明书要求, 这样就能保证检测结果的准确性, 避免出现假阴性或者假阳性。
摘要：目的 探讨ELISA法在检测HIV抗体中的影响因素, 提高实验结果准确性。方法 从试剂的准备、样品的采集和储存以及仪器和操作等方面分析每一环节的质量控制对检验结果的准确性所起到的影响。结果 做好试剂的选择和准备, 规范操作, 做好每一环节的质量控制, 在ELISA法检测HIV抗体中非常重要。结论 选择灵敏度高、特异性好的试剂, 严格按照试剂说明书要求, 注意操作中的诸多影响因素, 能有效保证检测结果的准确性。
关键词：ELISA法,HIV抗体,影响因素
参考文献
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