固态发酵工艺范文

固态发酵工艺范文（精选8篇）

固态发酵工艺 第1篇

固体发酵历史悠久,早在几千年前我国已开始应用发酵技术于中药发酵,直到现在临床仍有应用,如六神曲、半夏曲、淡豆豉等,其工艺均为固体发酵[4]。中药经发酵后可以减毒增效[5],提高有效成分含量[6],产生新的化合物[7]。

本试验首次采用纳豆芽孢杆菌对软枣进行固态发酵,以总黄酮含量和活菌数为考察指标,先对发酵温度进行单因素考察,再通过正交试验筛选发酵的最佳工艺,并将发酵前后的软枣进行体外实验,考察发酵前后抗癌作用的变化,为软枣进一步开发利用打下基础。

1材料与试剂

1.1材料

纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis 1.0504),购于中国科学院微生物菌种保藏中心;人肝癌细胞株SMMC-7721由上海复蒙生物有限公司提供;芦丁(110831-200503),购于中国药品生物制品鉴定所;软枣猕猴桃采于辽宁西丰,经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为正品;四甲基偶氮唑盐(MTT):美国GIBCO公司出品;二甲基亚砜(DMSO):北京索莱宝科技有限公司。

1.2仪器

紫外可见双光束扫描分光光度计(U-3010,日本日立公司);恒温振荡培养箱(HZQ-F160,哈尔滨东联电子技术开发有限公司);电热恒温培养箱(DNP9052,上海精宏试验设备有限公司);AE31型倒置相差显微镜(Motic公司)。

2试验方法

2.1菌种活化与种子液的制备

从斜面培养基取一环菌落转接于液体培养基,于37℃170r/min培养24h。

2.2药材的预处理

将软枣粉碎成粗粉。大豆浸泡12h沥干水备用。

2.3对照品溶液的制备

精密称取干燥芦丁对照品10.14mg,加60%乙醇制成每1mL含405.6μg的溶液,即得。

2.4供试品溶液的制备

取发酵后样品挑出大豆,以10倍量60%乙醇进行回流提取3次,每次2h,合并滤液,浓缩定容至250mL容量瓶中,从容量瓶中精密吸取1.0mL溶液,转移至25mL容量瓶中,稀释至刻度,摇匀,即得。

2.5线性及线性范围

精密吸取芦丁对照品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL,分别置于25mL容量瓶中,依次加入5%亚硝酸钠1mL,摇匀,静置6min,加入10%硝酸铝1mL,摇匀,静置6min,加入4%氢氧化钠5mL,用60%乙醇溶液定容至刻度,摇匀,静置15min。以0号为空白对照,在510nm进行测定,以吸收度A为纵坐标,以芦丁浓度C(μg·mL-1)为横坐标绘制标准曲线,总黄酮含量在8.112～48.672μg/mL呈良好的线性关系,回归方程为y=13.098x-0.011 5(R=0.999 3)。

2.6活菌计数法

采用平皿稀释涂布计数法,在无菌条件下取发酵样品约2g,在无菌离心管中加入10mL无菌水充分震荡,使之混匀,1 000r/min离心5min,吸取1mL上清液作十倍量稀释,依次做9次,吸取第7、8、9三个梯度的0.2mL菌液,均匀涂布于上述固体平面培养基上,每个梯度做3个平行,于37 ℃恒温培养,培养24h后进行肉眼计数。

2.7单因素考察

以总黄酮含量和活菌数为指标,对发酵温度进行单因素考察。

2.8正交试验考察

根据单因素试验结果,选取因素及水平,进行正交试验,以总黄酮和活菌数为指标采用综合评分(权重系数各为0.5)确定最佳发酵条件。

2.9软枣发酵前后作用于人肝癌细胞SMMC-7721

采用MTT法检测。取人肝癌细胞SMMC-7721,DMEM培养基(内含10% 胎牛血清)培养,取处于指数生长期状态良好的细胞,计数5×104个/mL,将细胞接于96孔板,培养24h,加药。实验分为空白组(不加药),发酵组,未发酵组。发酵组、未发酵组浓度分别为(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL),每个样品5个复孔。5%CO2 培养箱中培养72h。72h后将MTT加入96孔板,培养箱中反应4h,加入DMSO,用酶标仪在波长为492nm处测定吸光值A,并计算细胞抑制率。抑制率=(A对照组-A用药组)/A对照组×100%。

3试验结果

3.1单因素考察

保持软枣与大豆配比5:3,初始含水量80%,接种量5%,发酵4天等条件一致发酵温度分别为29℃、33℃、37℃、41℃、45℃分别进行发酵,发酵后分别测定其总黄酮含量和活菌数。结果见表1。

由表1可以看出,随着发酵时间的变化,总黄酮含量和活菌数呈现先上升后下降趋势。当微生物处于最适宜的温度时,生长速率最大,代谢旺盛;当温度过高或过低微生物停止生长甚至死亡。当温度高于37℃时,温度影响微生物活性,进而影响发酵,结果表明发酵温度选用37℃时,总黄酮含量最高,活菌数最多。

3.2正交试验

根据单因素考察结果,进行L9(34)正交试验设计,发酵温度37 ℃,测定发酵后总黄酮的含量和活菌数具体条件见表2,结果采用加权综合评分,以总黄酮的含量和活菌数为指标(权重系数各为0.5),最终确定固态发酵最佳条件,见表3。

由直观分析和方差分析对试验结果进行分析,结果表明软枣与纳豆配比对发酵效果有显著影响(P<0.05),发酵时间、含水量、接种量对发酵效果无显著影响(P>0.05),对发酵效果影响大小顺序依次为A>B>C>D,即配比>发酵时间>初始含水量>接种量。由直观分析得软枣与纳豆混合发酵最佳工艺为A2B2C2D3,即软枣与大豆配比为5:3,发酵时间为4天,初始含水量为100%,接种量为15%。

3.3软枣发酵工艺验证

试验为了进一步考察优选工艺的可靠性及稳定性,按上述最优工艺条件A2B2C2D3进行验证试验,结果总黄酮含量为19.595 7mg/g、18.936 1mg/g、18.595 7mg/g,平均含量19.042 5mg/g,RSD为2.67%,小于3%,说明软枣发酵工艺稳定、可行。

注:总黄酮评分(X)=总黄酮含量/最大总黄酮含量×0.5;活菌数评分(Y)=活菌数/最大活菌数×0.5;综合评分(Q) = X + Y。

注:F0.05(2,2)=19.00;*为P<0.05。

3.4软枣发酵前后作用于人肝癌细胞SMMC-7721

将软枣发酵前后分别进行体外细胞药效学试验,测量OD值,计算抑制率,结果见表4。

注:每一浓度均与各自的对照组相比较,*P<0.05。

由上表可知,由体外细胞药效学试验结果表明,软枣发酵后,抗癌作用增强。发酵前最大抑制率为36.44%,发酵后抑制率达到46.79%。

4讨论

笔者对软枣与大豆配比、发酵时间、初始含水量、接种量均进行了单因素考察,以软枣为固态发酵基质加入适量大豆,大豆的加入不仅可以起到养料的作用,还可以起到骨架的支撑作用,保证氧气的充足。当大豆比例过大,软枣粉过于分散,不利于发酵;当大豆比例过小,软枣粉过于密集,发酵过程处于缺氧状态,不利于纳豆菌的生长,同样也不利于发酵。发酵时间考察表明,当菌种刚接入到固体培养基时,需要适应新的生长环境,当发酵时间过短,菌种代谢还没变得活跃、旺盛,酶活性没达到最高,不利于发酵;当发酵时间过长,有毒代谢产物不断积累,培养基的营养物质被消耗,大量的菌体衰亡,培养基中生化反应停止,进而影响发酵过程。培养基初始含水量的考察表明,当培养基含水量过高时,微生物处于缺氧环境,影响生长;当培养基含水量过低时,微生物细胞出现脱水,引起质壁分离,甚至死亡。接种量的考察表明,当接种量过高,微生物数量过大,繁殖过剩,培养基中的营养物质被快速消耗,不利于发酵,进而影响发酵过程。接种量过低,微生物过于分散,同样也不利于发酵。

本试验首次通过以软枣为基质进行最优发酵工艺考察,以总黄酮含量和活菌数为指标,筛选最佳发酵工艺为发酵温度为37℃,软枣与大豆配比为5:3,发酵时间为4天,初始含水量为100%,接种量为15%。按照此最佳工艺条件进行验证性试验,结果表明该结果具有重复性,提示该发酵工艺稳定、可行,并为软枣的开发应用研究奠定了试验基础。

本文对未经发酵的软枣进行总黄酮测定,含量为14.078 4mg/g,试验结果表明发酵后总黄酮含量增加35.26%。体外药效学研究表明,抗癌作用增强。黄酮类成分具有降血脂、降血压、抗癌等药理作用,软枣经发酵后总黄酮含量增高,其药理作用也会相应变化,笔者会对其抗癌作用进行深入研究,为生产抗癌类药物提供试验基础。

摘要：目的:筛选软枣固态发酵的最佳发酵工艺及比较软枣发酵前后的抗癌效果。方法:采用纳豆芽孢杆菌对软枣进行固态发酵,以总黄酮含量和活菌数为考察指标,首先对发酵温度进行单因素考察,再采用正交设计进行优选,最终筛选出软枣发酵的最佳发酵工艺。采用MTT法,考察软枣发酵前后对人肝癌细胞SMMC-7721的作用效果。结果:软枣固态发酵最佳工艺为发酵温度为37℃,软枣与大豆配比为5:3,发酵时间为4天,初始含水量为100%,接种量为15%。软枣发酵后产物的抗癌作用强于发酵前软枣。结论:验证试验表明,筛选的软枣固态发酵最佳发酵工艺稳定、可行,发酵后抗癌效果增强,本试验为充分利用此药材提供了基础资料。

关键词：固态发酵,软枣猕猴桃,抗癌

参考文献

[1]江苏医学院.中药大词典(上册)[M].上海:上海人民出版社,1977:1324.

[2]马月申,袁福贵,赵淑兰,等.软枣猕猴桃果实营养成分的测定[J].特产研究,1992,8(1):44-45.

[3]张兰杰,谷昊,随晓慧,等.野生软枣猕猴桃总黄酮含量的测定[J].中国野生植物资源,2005,24(4):49-52.

[4]杜道辉,刘亚明.发酵技术在中药配伍中的应用概述[J].世界中西医结合杂志,2008,3(1):55-57.

[5]潘扬,张弦,蒋亚平,等.双向发酵前后马钱子生物碱含量及其HPLC指纹谱的比较[J].南京中医药大学学报,2006,22(6):362-365.

[6]徐萌萌,沈竞,徐春,等.槐米固态发酵提高槲皮素含量的研究[J].时珍国医国药,2008,19(3):704-706.

固态发酵工艺 第2篇

关键词:苹果渣;固态发酵;复合酶;培养基;优化

中图分类号:TS202.3文献标识号:A文章编号:1001-4942(2010)01-0080-06

Optimization of Solid-state Fermentation Medium for Production

of Complex Enzymes with Apple Pomace

JIANG Xin1, CHEN Wei1*, ZHOU Bo2*

(1.College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China;2.

College of Life Science, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China)

Abstract With the activity of cellulase, xylanase and pectinase as the determination indicators, the optimization of medium composition was investigated in solid-state fermentation of apple pomace by Aspergillus niger C-2. The culture medium was optimized using L9 (34) orthogonal design, range analysis, variance analysis and test of significance between the levels of different factors , so as to get a more reasonable result.As the result, the optimized medium composition was apple pomace∶bran = 4∶1, ammonium sulfate of 2.0%, potassium hydrogen phosphate of 0.1%, urea of 2.5%. Compared with the basic medium, the activity of three enzyme was increased by 64.19%,17.26% and 20.89%, respectively.

Key words Apple pomace; Solid-state fermentation; Complex enzyme; Medium; Optimization

苹果渣是指苹果榨汁后的副产物,主要由果皮、果核和残余果肉组成,约占鲜果质量的25%。我国年产苹果约2 000×104 t,在加工果汁的过程中所排出的果渣约有100×104 t。由于苹果渣含有较高水分(约75%~80%)和丰富的营养物质,易被微生物侵染,发霉、腐烂变质,导致环境污染和资源浪费[1,2]。苹果加工后的大量残渣含有果胶、纤维素和蛋白质等,可作为饲料、提取膳食纤维、果胶原料的来源、培养食用菌、提取低聚糖、生产酶等等。该领域的商品开发在国内外都尚处于起步阶段,如何利用这种食品下脚料是当前的研究及开发热点[3]。

1 材料与方法

1.1 材料

干苹果渣:由天津牧光生物有限公司提供,pH 4.6。

菌种:黑曲霉C-2(Aspergillus niger),为山东农业大学菌种保藏中心保藏。

1.2 培养基

菌种活化培养基为:麸皮200 g,玉米芯40 g,加水煮沸30 min,过滤,加入2.0%硫酸铵,0.2%磷酸氢二钾,补水到1 L。

固态发酵基础培养基:苹果渣(烘干)15 g,2.0%硫酸铵,pH自然,发酵周期2 d,10%接种量,固水比=1∶1。

1.3 测定方法

本试验测定三种酶活性,即纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶。方法为DNS法[4]。

酶活单位定义:在40℃、pH值为4.6的条件下,每分钟从浓度为5 mg/ml的底物溶液中分解释放1 μmol还原物质所需要的酶量为一个酶活单位U。

1.4 正交试验设计

通过前期单因素试验,确定硫酸铵添加量(A),磷酸氢二钾添加量(B),尿素添加量(C),果渣和麸皮的添加比例(D)4个因素,各取3个水平,以发酵产物的纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶3种酶活性大小作为考察指标,进行L9(34)正交试验,控制发酵时间为48 h。试验因素与水平见表1。

表1正交试验因素与水平(%)

水平因素硫酸铵(A)磷酸氢二钾(B)尿素(C)果渣∶麸皮(D)

11.00.11.51∶1

22.00.22.04∶1

33.00.42.52∶1

1.5 分析方法

运用DPS v7.05软件进行正交试验设计和分析,正交试验方差分析时选用Duncan 新复极差法进行多重比较,用Origin75做图,用SPSS13.0进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 发酵周期的确定

以基础培养基发酵微生物,每12 h测定发酵产物的纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶活性,找到最大酶活产生的时间,即最佳发酵时间。

由图1可以看出,纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶活性在发酵前期48 h内快速增加,48 h达到酶活最大值,此时纤维素酶活为(66.72±0.049)U/g,木聚糖酶活为(363.78±4.085)U/g,果胶酶活为(732.46±2.055)U/g。此后,菌体开始有孢子出现,96 h达到酶活值的第二个高峰,但此时菌体孢子致密,之后酶活值下降。也就是说大部分酶是在菌丝旺盛生长时产生的,因此48 h为该菌株产酶的最佳培养时间。

图1 三种酶活力随时间变化规律

2.2 含水量对酶活性的影响

2.2.1 料水比对酶活性的影响 料水比是指果渣麸皮与水的比值。料水比越大,发酵物的粘度越大,物料的通透性越差,发酵温度较高,对菌体生长影响较大,酶活性会下降。因此选择适宜的料水比,增加物料通透性是发酵成功与否的关键。设计料水比分别为1∶0.5、1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.6,测定不同的料水比对三种酶活力的影响。

从图2中可以看出,当料水比为1∶0.51∶0.8时,三种酶活相对偏低;当料水比为1∶1.2时,三种酶活达到最大值;当料水比>1∶1.2时,

图2 三种酶活力随料水比变化规律

酶活有所下降。说明水分太少会导致菌体脱水,不能进行正常的生长代谢;而水分太多,底物变得黏稠,只有表面接触到空气的部分可以生长孢子,而靠近瓶底的深层部分因为接触不到空气,而降低了酶的活性。所以料水比确定为1∶1.2。

2.2.2 发酵过程中水分变化的测定 含水量是指物料含水的多少。含水量较高,物料多孔性降低,减少了物料内气体的体积和气体交换,难以通风、降温,增加杂菌污染的危险;含水量低时,物料膨胀程度低,微生物生长受抑制,后期由于微生物生长及水分蒸发造成物料较干,微生物难以生长,产量降低,影响产品质量[5]。在料水比1∶1.2的情况下,不补水,每24 h测定培养基的水分含量。取0、1、2、3、4、5 d的固体发酵培养基1 g,放入烘箱105℃,烘烤24 h,测定水分消耗率,每组3个平行。

由图3可以看出,在发酵前3天,水分变化相对平稳,以每天3%左右的百分率消耗,3天后水分消耗加剧。所以应适量补充水分,以满足微生物的正常生长。补水量为每瓶培养基每天补水1 ml。

图3 发酵过程中水分变化规律

2.2.3 补水与不补水对酶活性的影响 将每瓶培养基发酵2 d,不补水,测定酶活;将培养基发酵2 d,每天补水1 ml/瓶,测定酶活,将两者对比,看是否需要补水。三种酶活变化分别见图4。

由图4可以看出,发酵第1天补水处理的三种酶活性均有所降低,第2、3天补水后三种酶活性都增加。这可能是因为发酵第1天,培养基本身水分适宜,补水后,水分含量过高,造成培养基透气性差,菌体生长不良,产酶效果不好。发酵的后两天,由于菌体生长、产热消耗了一部分水分,水分含量偏低;补水后三种酶活性均有小幅度的增长,说明补水后水分含量适宜菌体生长,产酶效果良好。所以应从发酵第2天开始,每天补水1ml/瓶,对酶活有一定的提高作用。

图4 补水与不补水三种酶活随发酵时间变化

2.3 三种酶活性正交试验结果

2.3.1 正交试验纤维素酶活结果 由表2的R值分析可知,A>C>D>B,对固态发酵培养基产纤维素酶活影响最大的因素是硫酸铵添加量,其次是尿素添加量,再次是果渣和麸皮的比例,磷酸氢二钾添加量影响最小。

表2正交试验纤维素酶活结果

试验号硫酸铵(A)磷酸氢二钾(B)尿素(C)果渣∶麸皮(D)纤维素酶活性(U/g)

1111129.58 32.32

2122232.90 33.68

3133334.39 35.23

4212332.9 35.36

5223131.64 34.50

6231231.73 33.91

7313230.46 33.20

8321328.32 28.65

9332126.30 27.36

K1198.10193.82184.50181.70

K2200.04189.69188.50195.87

K3174.29188.91199.42194.85

K1平均33.0232.3030.7530.28

K2平均33.3431.6131.4232.65

K3平均29.0531.4933.2432.48

R4.290.812.492.37

运用DPS v7.05软件进行方差分析,选用Duncan 新复极差法作多重比较。由方差分析表3可以看出,硫酸铵添加量、尿素添加量和果渣麸皮比例对纤维素酶活的影响极显著;而磷酸氢二钾添加量对纤维素酶活影响不显著。

表3 正交设计纤维素酶活方差分析表

(随机区组模型)

变异来源平方和自由度均方F值显著性

区组14.1867114.1867

第1列68.5105234.255267.4281**

第2列2.320721.16042.2841不显著

第3列19.880729.940419.5666**

第4列20.8195210.409820.4906**

误差4.064280.5080

总和129.7824

由表4可以看出,处理因子A的水平2与水平1差异不显著,但均与水平3差异显著,即硫酸铵添加量选择水平2和水平1对纤维素酶活都有利,为了得到最大活性,选择水平2,即硫酸铵2.0%。处理因子B的3个水平之间差异不显著,按照最经济的原则,选择水平1,即磷酸氢二钾0.1%。处理因子C的水平3与水平2、1之间差异显著,后两者之间差异不显著,为得到最大活性,选择水平3,即尿素2.5%。处理因子D的水平2、3差异不显著,均与水平1差异显著。本试验的原料果渣廉价易得,且为主要利用物,故选择水平2,即果渣∶麸皮=4∶1。

表4不同因素水平间差异显著性检验结果

硫酸铵(A)水平均值5%显著水平磷酸氢二钾(B)水平均值5%显著水平尿素(C)水平均值5%显著水平果渣∶麸皮(D)水平均值5%显著水平

233.3383a132.3033a333.2367a232.6450a

133.0167a231.6150a231.4167b332.4750a

329.0483b331.4850a130.7500b130.2833b

综上分析得:纤维素酶活最好的试验组合为A2B1C3D2,即最优培养基组成为硫酸铵2.0%,磷酸氢二钾0.1%,尿素2.5%,果渣∶麸皮=4∶1。

2.3.2 正交试验木聚糖酶活结果 由表5的R值分析可知,A>C>D>B,对固态发酵培养基产木聚糖酶活影响最大的因素是硫酸铵添加量,其次是尿素添加量,再次是果渣和麸皮的比例,磷酸氢二钾添加量影响最小。

表5正交试验木聚糖酶活结果

试验号硫酸铵(A)磷酸氢二钾(B)尿素(C)果渣∶麸皮(D)木聚糖酶活性(U/g)

11111321.03 332.4

21222534.35 542.24

31333471.32 473.29

42123536.39 578.43

52231645.06 652.37

62312504.14 502.78

73132441.43 431.54

83213131.28 132.42

93321306.16 307.26

K12674.632641.221924.052564.28

K23419.172637.722804.832956.48

K31750.092564.953115.012323.13

K1平均445.77440.20320.68427.38

K2平均569.86439.62467.47492.75

K3平均291.68427.49519.17387.19

R278.1812.71198.49105.56

由方差分析(表6)可以看出,硫酸铵添加量、尿素添加量、果渣麸皮比例对木聚糖酶活的影响极显著;磷酸氢二钾对木聚糖酶活影响不显著。

表6 正交设计木聚糖酶活方差分析表

(随机区组模型)

变异来源平方和自由度均方F值显著性

区组210.60361210.6036

第1列233052.33722116526.16861098.5445**

第2列618.04642309.02322.9133不显著

第3列127242.8201263621.4101599.7876**

第4列34061.4658217030.7329160.5564**

误差848.58588106.0732

总和396033.8590

由表7可以看出,处理因子A的3个水平间差异显著,选择水平2为最佳,即硫酸铵2.0%。处理因子B的3个水平差异不显著,从经济的角度考虑,选择水平1,即磷酸氢二钾0.1%。处理因子C的3个水平间差异显著,选择水平3最佳,即尿素2.5%。处理因子D的3个水平差异显著,选择水平2,即果渣∶麸皮=4∶1。

综合上述分析可知,木聚糖酶活最好的试验组合为A2B1C3D2,即最优培养基组成为硫酸铵2.0%,磷酸氢二钾0.1%,尿素2.5%,果渣∶麸皮=4∶1。

表7不同因素水平间差异显著性检验结果

硫酸铵(A)水平均值5%显著水平磷酸氢二钾(B)水平均值5%显著水平尿 素(C)水平均值5%显著水平果渣∶麸皮(D)水平均值5%显著水平

2569.8617a1440.2033a3519.1683a2492.7467a

1445.7717b2439.6200a2467.4717b1427.3800b

3291.6817c3427.4917a1320.6750c3387.1883c

2.3.3 正交试验果胶酶活结果 由表8的 R值可知,D>A>B>C,对固态发酵培养基产果胶酶活影响最大的因素是果渣和麸皮的比例,其次是硫酸铵添加量,再次是磷酸氢二钾添加量,而尿素添加量影响最小。

表8正交试验果胶酶活结果

试验号硫酸铵(A)磷酸氢二钾(B)尿素(C)果渣∶麸皮(D)果胶酶活性(U/g)

11111580.63 577.32

21222806.34 798.67

31333776.45 767.67

42123808.67 853.23

52231587.75 577.68

62312820.78 832.89

73132702.26 696.56

83213699.66 690.23

93321450.24 463.24

K14307.084218.674201.513236.86

K24481.004160.334180.394657.50

K33702.194111.274108.374595.91

K1平均717.8467703.1117700.2517539.4767

K2平均746.8333693.3883696.7317776.2500

K3平均617.0317685.2117684.7283765.9850

R129.801717.900015.5233236.7733

由方差分析(表9)可以看出,硫酸铵添加量、果渣麸皮比例对果胶酶活影响都极显著,尿素添加量、磷酸氢二钾添加量对果胶酶活影响不显著。

表9 正交设计果胶酶活方差分析

(随机区组模型)

变异来源平方和自由度均方F值显著性

区组33.9213133.9213

第1列55704.7275227852.3637171.1953**

第2列963.62222481.81112.9615不显著

第3列794.88862397.44432.4429不显著

第4列214946.01332107473.0067660.5857**

误差1301.54818162.6935

总和273744.7210

由表10可知,处理因子A的3个水平之间差异显著,水平2最好;处理因子B的水平1最好;处理因子C的水平间差异不显著,从经济方面考虑,低添加量最好,选择水平1;处理因子D的水平2、3间差异不显著,均显著高于水平1,选择水平2。

综合上述分析,果胶酶活最好的试验组合为A2B1C1D2,即最优培养基组成为硫酸铵2.0%,磷酸氢二钾0.1%,尿素1.5%,果渣∶麸皮=4∶1。

表10不同因素水平间差异显著性检验结果

硫酸铵(A)水平均值5%显著水平磷酸氢二钾(B)水平均值5%显著水平尿 素(C)水平均值5%显著水平果渣∶麸皮(D)水平均值5%显著水平

2746.8333a1703.1117a1700.2517a2776.2500a

1717.8467b2693.3883ab2696.7317a3765.9850a

3617.0317c3685.2117b3684.7283a1539.4767b2.3.4 正交试验结果的分析 对上述正交试验结果进行综合分析,结果表明,纤维素酶活最好的试验组合为A2B1C3D2,木聚糖酶活为A2B1C3D2,果胶酶活为A2B1C1D2,可以看出,三种酶活对培养基的硫酸铵、磷酸氢二钾、果渣麸皮比例要求一致,分别为2.0%、0.1%和4∶1;而在尿素的添加量上存在差异,纤维素酶和木聚糖酶的最适添加量为2.5%,而果胶酶要求1.5%。 

试验的目的是得出三种酶活都较高的最适培养基,所以对尿素的添加量需要统一。对三个方差分析表进行综合分析,尿素添加量对纤维素酶活和木聚糖酶活的影响极显著,而对果胶酶活影响不显著。从这点上看,尿素添加量最终选定为2.5%。

固态发酵产复合酶本身是一个混合体系,所以应选择三种酶活性均较高的优化组合。本试验得到苹果渣固态发酵产复合酶优化后培养基配方:硫酸铵2.0%,磷酸氢二钾0.1%,尿素2.5%,果渣∶麸皮=4∶1。

2.4 补充试验

将苹果渣按照基础培养基和优化后培养基配方进行发酵,48 h后比较三种酶活的大小。基础培养基:纤维素酶活(U/g)为66.72±0.049,木聚糖酶活363.78±4.085,果胶酶活732.46±2.055;优化后培养基:纤维素酶活为109.55±0.124,木聚糖酶活426.56±2.130,果胶酶活885.50±3.015。采用优化后培养基,三种酶活分别较基础培养基提高了64.19%、17.26%、20.89%。

3 结论

3.1 最佳发酵周期的确定:以基础培养基发酵微生物,每12 h测定发酵产物的纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶活性,探索最大酶活产生的时间,得到最佳发酵时间为48 h。

3.2 最佳料水比确定为1∶1.2。发酵过程中水分的变化测定发现,在发酵前3天,水分变化相对平稳,以每天3%左右的百分率消耗,此后水分消耗加大,应每天补水1 ml/瓶。补水与不补水的对比试验表明,补水后三种酶活均有小幅度增大,但发酵第1天例外,因为发酵初期培养基水分含量高,此时补水会造成通氧效果差,影响菌体生长。发酵中由于产热,消耗水分,所以从发酵第2天起,每天补水1 ml/瓶,对酶活有一定的提高作用。

3.3 通过正交试验,同时运用极差分析、方差分析以及不同因素水平间差异显著性检验对结果进行分析,确定优化后培养基配方为:硫酸铵2.0%,磷酸氢二钾0.1%,尿素2.5%,果渣∶麸皮=4∶1。优化后的三种酶活比基础培养基分别提高了64.19%、17.26%和20.89%。

致谢:承蒙山东农业大学植物保护学院于金凤教授帮助分析数据,谨致谢意。

参 考 文 献:

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中药黄芪渣固态发酵工艺条件的优化 第3篇

1材料

1. 1黄芪药渣

黄芪药渣由河北远征药业有限公司提供,湿物料烘干后粉碎过筛,置塑料袋中备用。本试验所用黄芪药渣中真蛋白含量为9. 12% 。

1. 2菌源

嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌,由河北远征药业有限公司分离纯化并按照一定比例制成混合菌粉。

1. 3 MRS培养基

牛肉膏10. 0 g、蛋白胨10. 0 g、酵母粉5. 0 g、葡萄糖20. 0 g、磷酸氢二钾2. 0 g、Na Ac·3H2O 5. 0 g、 柠檬酸二铵2. 0 g、Mg SO4·7H2O 0. 58 g、Mn SO4· H2O 0. 25 g、吐温- 80 1. 0 m L,补水至1 000 m L( 琼脂粉含量为1. 5% ~ 2. 0% ) ,初始p H值为( 6. 4 ± 0. 2) ,121 ℃ 灭菌15 min,用于乳酸菌活菌计数。

2方法

2. 1固态发酵

称取适量菌粉,加入红糖水密封活化2 h,将活化好的菌种接种到含有玉米粉和麸皮的药渣中,搅拌均匀,密封置室温条件下发酵一定时间。

2. 2优化试验

采用单因素试验,以发酵后药渣中形成的菌落数和真蛋白含量作为评价指标,分别考查玉米粉和麸皮添加量、硫酸铵添加量、接种量、水分含量、发酵温度、 发酵时间对菌种发酵的影响。

2. 3活菌计数

采用稀释平板计数法。称取发酵好的黄芪药渣1. 0 g,放入9. 0 m L无菌纯化水中,充分振荡混匀,取此溶液1. 0 m L依次做10倍梯度稀释,选取适宜的连续2 ~ 3个梯度的稀释液0. 1 m L注入到MRS平板上,均匀涂布,每个梯度做3组平行,在37 ℃ 条件下倒置厌氧培养36 ~ 48 h,选取菌落数在30 ~ 300的平板计数,计算同浓度下菌落的平均值。计算公式: 发酵后活菌数= 同一稀释度3组平行的平均菌落数 × 稀释倍数/药渣称样量。

2. 4真蛋白含量的测定

将发酵好的固体药渣置70 ℃ 烘箱中烘干,利用凯氏定氮法测定真蛋白含量。

3结果与分析

3. 1碳源添加量对菌种发酵黄芪药渣的影响

碳源在微生物生长中起着非常重要的作用,为微生物的生长代谢、细胞生长分裂提供所需能量和碳架。黄芪药渣中含有较多纤维素、半纤维素和果胶, 不能被菌种直接利用,因此试验添加了一定量的玉米粉和麸皮的混合物作为碳源,旨在为乳酸菌的生长提供能量。碳源添加量对乳酸菌发酵的影响见图1。

由图1可知,随着黄芪药渣中碳源添加量的增加,菌落数和真蛋白含量逐渐增加,当黄芪药渣中添加40 mg玉米粉和麸皮时,菌落数和真蛋白含量增长趋势明显,之后随着碳源的增加,菌落数和真蛋白含量略微下降后趋于平稳,因此选择玉米粉和麸皮的添加量为40 ~ 80 mg。

3. 2氮源添加量对菌种发酵黄芪药渣的影响

氮源在微生物生长中起着重要作用,硫酸铵由于价廉易得,常被作为氮源来使用。氮源添加量对乳酸菌发酵的影响见图2。

由图2可知,添加少量的硫酸铵作为氮源可以促进菌体生长,当硫酸铵添加量为10 mg时菌体达到最大浓度,超过最大浓度后菌落数和真蛋白含量开始下滑,可能是由于硫酸铵添加量不同时MRS培养基的酸碱性不同,因此硫酸铵添加量在一定程度上影响菌落数的生长。

3. 3接种量对乳酸菌发酵的影响( 结果见图3)

由图3可知,随着接种量的增加,菌落数呈现一定的上升趋势,当接种量为0. 4% 时菌落数和真蛋白含量均达到最大值,继续提高接种量,二者含量均有不同的下降趋势,这可能是由接种量增大后菌体迅速增长,营养物质消耗失衡,有害代谢产物增多所致。

3. 4水分含量对乳酸菌发酵的影响

水分含量的多少直接影响菌体的生长情况,在固态发酵过程中,适当的水分能促进营养物质的传输和菌体的生长繁殖。水分含量过少时,药渣的蓬松度会降低,影响菌体的生长; 水分含量过高时,药渣易黏连结块,菌体自身容易酸败腐烂,影响发酵效果。水分含量对乳酸菌发酵的影响见图4。

由图4可知: MRS培养基中水分含量为50% 时菌落数最多,为1. 9 × 109cfu / g; 真蛋白含量随着菌落数增加而增加,在水分含量为50% 时也达到最大。 因此,选择水分含量为50% 左右。

3. 5发酵温度对乳酸菌发酵的影响

乳酸菌在37 ℃时生长状况良好,因此初步选择28 ~ 40 ℃ 作为发酵温度。发酵温度对乳酸菌发酵的影响见图5。

由图5可知,温度为32 ℃ 时菌落数达到最大, 真蛋白含量在36 ℃ 时含量达到最大,当温度增加到40 ℃ 时菌落数和真蛋白含量均呈下降趋势。

3. 6发酵时间对乳酸菌发酵的影响

菌体发酵初期,营养成分充足,条件适宜,菌种生长速度较快,当菌体生长到一定浓度时,培养基成分发生变化,同时菌体生长过程中产生的有害物质和有机酸使培养基成分发生改变,菌体在达到一定浓度后逐渐开始衰亡。发酵时间对乳酸菌发酵的影响见图6。

由图6可知,菌落数随着发酵时间的延长逐渐增多,在发酵96小时时达到最大值( 1. 77 × 109cfu / g) ,达到峰值之后菌落数开始呈下降趋势,真蛋白含量增长趋势和菌体增长趋势大体相同,也在发酵96小时时达到最大值,因此菌种发酵时间范围选择为72 ~ 96 h。

3. 7正交试验

根据上述单因素试验结果进行正交试验以确定最佳工艺条件。正交试验选定碳源添加量( A) 、水分含量( B) 、发酵温度( C) 、发酵时间( D) 4个因素及其适宜范围进行黄芪药渣固态发酵的优化试验。正交试验的因素与水平设置见表1。

单因素试验中以菌落数和真蛋白含量共同作为参考指标进行优化,考虑到菌落数和真蛋白含量均能有效表达优化效果,因此正交试验仅选择真蛋白含量作为分析标准,结果见表2。

由表2可知,试验中各因素对菌种发酵情况影响的顺序为: 碳源添加量> 水分含量> 发酵温度> 发酵时间。碳源添加量对菌落数生长影响最大,玉米粉和麸皮含有菌体生长所需要的各种元素,不仅为菌种发酵提供碳源还能提供微量元素; 水分含量对菌种发酵也有非常重要的作用。

正交试验结果分析的最佳发酵条件: 玉米粉和麸皮的添加量为60 mg,水分含量为50% ,发酵温度为30 ℃ ,发酵时间为96 h,即最佳组合为A2B2C1D2。

在上述条件下进行验证试验,结果见表3。

%

由表3可知,在A2B2C1D2条件下真蛋白含量优于A2B2C3D1条件,而且经测定菌落数也有一定提高, 达到2. 3 × 109cfu / g,因此将A2B2C1D2即玉米粉和麸皮的添加量为60 mg,水分含量为50% ,发酵温度为30 ℃ ,发酵时间96 h作为试验的最终发酵条件。

4讨论

利用中药渣发酵生产单细胞蛋白作为饲料添加剂是近年来饲料工业研究的一个热点,将药渣变废为宝不仅能减少对空气和环境的污染,而且通过微生物发酵产生的有益菌能够提高饲料菌体蛋白的含量,同时菌体生长代谢过程中产生的有机酸和各种酶类对动物的生理功能和免疫反应都有一定作用。同时与液体发酵相比,固体发酵操作简单,便于工业化生产, 从而被企业所青睐。

固体发酵中影响因素很多,本试验首先选用单因素试验对影响因素进行初步测定,结果发现菌落数和真蛋白含量随着碳源添加量、水分含量、发酵温度和发酵时间的变化而发生变化的幅度偏大,在此单因素试验的基础上,再进一步对这几个影响较大的因素进行正交试验,选择出菌种发酵黄芪药渣的最佳条件, 在该优化条件下发酵黄芪药渣,不仅能使菌体蛋白以较快的速度生产,还能重复利用废弃药渣,为有益菌的工业化生产提供一定的参考价值。

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混菌固态发酵酒糟发酵条件的研究 第4篇

本试验主要是利用富集蛋白能力强的酵母菌和分解纤维素能力强的霉菌组合, 混菌固态发酵酒糟, 并进行发酵培养基及发酵参数的优化, 最后获取营养丰富的酒糟生物饲料。

一、材料和方法

1. 试验材料

(1) 原料 试验所用酒糟取自清徐酒厂。

(2) 菌种 产朊假丝酵母 (Candida Utilis 2.1005) :购自中国微生物菌种保藏中心, 毛霉-0415 (Mucor-0415) 、由动物科技学院微生物试验室提供。

(3) 培养基 麦芽汁培养基、PDA固体培养基、PDA液体培养基, 最佳培养基配方为:酒糟90%, 麸皮10%;添加尿素0.3%, 硫酸铵0.5%, 磷酸二氢钾0.5%, 含水量65%, 装量为30 g, 0.10~0.12 MPa, 灭菌40 min。

(4) 主要试剂 DNS试剂、羧甲基纤维素钠 (CMCNa) 溶液、0.1%的标准葡萄糖溶液、福林试剂、2%酪蛋白溶液、100 ug/m L酪氨酸溶液。

2. 培养方法

(1) 菌株的活化与扩大培养 在无菌操作台上将酵母菌转接到麦芽汁固体培养基上, 霉菌接到PDA培养基上, 在28℃恒温培养箱中培养3 d, 菌株长好后再次转管扩繁, 选取一部分作为试验种, 剩余菌种在4℃冰箱中保存备用。

(2) 液体菌种的制备 (1) 酵母菌液体菌种, 酵母经过斜面活化, 取一环接种于5 m L液体培养基的试管中, 28℃培养24 h, 转接于250 m L的三角瓶中, 装液量为50 m L, 接种量5%, 170 r/min, 28℃培养6~8 h。 (2) 霉菌液体菌种, 从活化的霉菌斜面上刮下几环孢子, 接种于PDA液体三角瓶培养基中, 28℃恒温培养5 d。

(3) 固体培养基 按最佳培养基配方将固态发酵料配制好后装入500 g罐头瓶内, 30 g/瓶, 每一组合3个重复, 用聚乙烯塑料封口, 在0.1~0.12 MPa, 高压灭菌锅内灭菌40 min, 待冷却后在无菌操作台上, 先接霉菌液体菌种24 h后接入酵母菌种, 接入比例1∶1, 接种量各5% (V/W) , 在28℃恒温培养箱培养6 d。

3. 发酵产物的分析方法

(1) 纤维素酶活测定 DNS显色法:温度50℃, p H4.8的条件下, 分解1%CMC钠溶液每分钟产生1 mg葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活单位U。

(2) 真蛋白含量测定

(3) 蛋白酶活的测定 在40℃下, p H7.2下每分钟水解酪蛋白为酪氨酸的微克数, 定义为一个蛋白酶活单位U。

(4) 纤维测定 (范氏中性、酸性洗涤纤维法)

4. 试验内容 (发酵参数的优化)

(1) 发酵参数最佳水平的确定 在最佳培养基组分的基础上, 分别研究水分、发酵温度、装瓶量、接种方式对固态发酵真蛋白的影响。

(2) 固态发酵参数的优化 为了更好的确定固态发酵参数对发酵效果的作用, 在水分、发酵温度、装瓶量、接种方式单因素试验的基础上, 正交设计, 确定最佳的发酵工艺。具体水平设计如下:四因素三水平L9 (34) 正交设计, 共九个处理, 每个处理3个重复。基础发酵方法及其他条件同上。

(3) 发酵周期的确定 在最优发酵条件下, 从第3 d开始每隔24 h取样, 监察发酵过程中真蛋白、纤维素酶、蛋白酶的变化情况。

(4) 发酵前后产物分析

5. 数据统计方法

数据经EXCEL和SAS软件方差分析

二、结果与分析

1. 发酵参数的优化

(1) 初始含水量对固态发酵的影响 在最优培养基的基础上按初始含水量55%, 60%, 65%, 70%, 75%进行固态发酵, 培养条件同 (1.2.3) 。从图1中看出, 当含水量小于65%时, 随着含水量的增加, 发酵物真蛋白含量逐渐增加;当含水量大于65%时, 随着含水量的增加, 发酵物真蛋白含量逐渐降低。因此, 培养料中适宜的含水量为65%。

(2) 装瓶量对固态发酵的影响 按装瓶量为20 g, 30g, 40 g, 50 g, 60 g, 70 g进行试验, 其他条件同上。结果表明:从20 g装瓶量开始真蛋白迅速增加, 到40 g真蛋白达到最高值, 随后随着装瓶量的增加, 真蛋白含量迅速降低 (见图2) 。

(3) 不同温度对固态发酵的影响 分别以24℃, 28℃, 30℃, 32℃, 34℃进行试验, 装瓶量40 g, 其他发酵条件不变。由图3可见, 当温度在24℃~30℃时, 随着温度的增加, 真蛋白含量不断增加, 在30℃时, 真蛋白含量达到最高, 以后随着温度的增加, 蛋白含量明显下降。所以, 经试验得出发酵最适温度为30℃。

(4) 固态发酵参数的优化 在水分、发酵温度、装瓶量、接种方式单因素试验的基础上, 进行正交设计, 确定最佳的发酵条件。具体水平设计如下:四因素三水平L9 (34) 正交设计, 共九个处理, 每个处理3个重复, 其他条件同上。

(5) 对试验结果进行直观分析如下 (1) 比较表2中各考察因素的极差R, 由于RA>RD>RB>RC, 所以各因素的主次顺序为A→D→B→C, 即温度是主要因素, 接种方式、瓶装次之, 含水量是次要因素。 (2) 以各因素不同水平下的均值从中可以看出, 对于因素A, B和D, 其均值———水平的变化趋势相似, 都是先升后降;因素C呈先降后升趋势。经比较后发现, A2, B2, C3, D2在各自因素的3个水平下产生的真蛋白含量最高。由方差分析 (P=0.05) 可以看出温度和接种方式对真蛋白的影响显著, 其他因素不显著。 (3) 由 (1) 、 (2) 可以确定固态发酵酒糟的最佳条件为A2, B2, C3, D2, 即发酵温度30℃, 40 g装瓶量, 含水量70%, 接种方式为先接霉菌24 h后接酵母。

2. 发酵周期的确定

在最优发酵条件下, 从第3天开始每隔24 h取样, 监察发酵过程中真蛋白、纤维素酶、蛋白酶的变化情况。由图4明显可以看出发酵过程中真蛋白、酶活的变化趋势, 在120 h蛋白酶达到最高点, 真蛋白和纤维素酶活力在144 h达到最高, 由此可以确定发酵培养时间为6 d。

3. 发酵前后产物的分析

经过菌种筛选, 培养基和培养条件优化得出混菌固态发酵酒糟的发酵培养基为酒糟90%, 麸皮10%, 添加尿素0.3%, 硫酸铵0.5%, 磷酸二氢钾0.5%;发酵条件为含水量70%, 接种量10%, 温度30℃, 装量40 g, 接霉菌24h后接酵母, 发酵时间为6 d。在此条件下进行发酵, 分析发酵前后产物的变化情况。

由表4可知:固态发酵酒糟后, 发酵物中含纤维素酶102.1U/g, 蛋白酶67.6 U/g, 真蛋白含量提高了27.44%, 中性纤维下降了5.53%, 因而该发酵物是一种优质的生物饲料。

三、讨论

1. 培养基初始含水量

培养基初始含水量是影响微生物生长和繁殖的一个重要因素, 它直接影响到蛋白含量的多少和酶活力的强弱;培养基含水量过少, 原料较疏松干燥, 营养物质传递困难, 菌株生长弱;培养基含水量过多, 原料易粘结成块, 通气不良, 导致发酵物的真蛋白含量低和酶活力弱;而含水量适宜, 有利于空气进入, 增加氧传递, 同时以有利于微生物代谢产物阻遏削减, 促进新陈代谢。

2. 温度

温度是影响微生物菌体生长繁殖的重要条件之一。菌体生长随温度变化, 温度高, 生长快, 温度低, 生长慢, 但温度过高, 热量不能传递出去, 对生长不利。

3. 通风量的多少

固态发酵工艺 第5篇

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与试剂

酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae No.2, 由吉林农业大学实验室筛选保藏, 玉米粉、豆粕、棉粕、麸皮;尿素、硫酸铵、氯化钠、硫酸钙、硫酸铵, 均为分析纯;麦芽汁培养基, 自制。

1.1.2 仪器

CHA-S 恒温振荡器、DHP-781 电热恒温培养箱、净化工作台、 AUY220 分析天平、 ZDX-35BI 蒸汽灭菌器、XS-212 生物显微镜。

1.2 方法

1.2.1 菌种准备

在无菌条件下挑取菌种至麦芽汁斜面培养基中, 30 ℃恒温培养48 h, 使菌种复壮。挑取斜面培养基上活化好的菌落, 接种至250 mL三角瓶中于28 ℃、120 r/min摇床培养24 h。

1.2.2 固态发酵培养基的制备与处理

以玉米粉、麸皮 (占干重的10%) 为基础碳源, 分别以豆粕、棉粕、尿素、硫酸铵为主要氮源, 加氯化钠 (0.5%) 、硫酸钙 (0.5%) , 含水量为60%, 配置碳氮比为20, 23, 26的固态发酵培养基, 接种后恒温培养。

配置以豆粕为氮源、碳氮比为23的8组培养基, 其中3组接种后分别置于25, 30, 35 ℃恒温培养;另5组于30 ℃培养条件下分别设定基质初始pH值为5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0。

固态发酵条件的优化:经多项单因素试验后, 采用正交试验设计L16 (4×4) , 固态发酵因素与水平见表1, 每组重复数为3, 接种后培养6 d。

1.2.3 酵母细胞数的测定与数据分析

分别于接种后0, 1, 2, 3, 4, 5, 6天同一时间取样0.5 g, 用生理盐水稀释后, 采用血细胞计数板对酵母细胞进行计数。对数据进行直观分析。正交试验统计采用极差法。

2 结果与分析

2.1 不同氮源固态发酵菌体数变化规律

以豆粕、棉粕、尿素、硫酸铵分别作为固态发酵培养基的氮源, 接种后6 d内的酵母菌体数变化见表2。

表2显示, 多数处理中酵母在发酵24 h后细胞数达到第一峰值, 4～5 d达到第二峰值, 6 d后细胞进入衰减期。以豆粕为主要氮源时, 在碳氮比为23的培养基中酵母生长状况最好;碳氮比为20时棉粕为主要氮源培养基的酵母细胞数最大, 碳氮比增大时峰值时间延迟;以尿素为氮源时, 不同的碳氮比均能达到相同峰值, 碳氮比增大时峰值时间延迟;以硫酸铵为氮源时, 酵母在碳氮比为20的基质中菌体数较高, 但长势较弱。

2.2 温度对固态发酵的影响 (见表3)

表3显示, 在接种后的24 h内当温度在30 ℃时酵母菌体数最大;温度在25 ℃时, 酵母菌体数在接种后第2天达到最高峰值。随着温度升高, 峰值达到时间延迟到第4天。

2.3 pH值对酵母固态发酵的影响 (见表4)

由表4可知, 在初始pH值为6.5的基质中, 发酵第5天时酵母细胞数最多, 但镜检发现基质中杂菌污染严重;pH值为5.5的基质中酵母数居其次, 镜检杂菌污染少。

2.4 酵母固态发酵条件的优化

采用正交试验设计, 对氮源、碳氮比、温度、基质pH值、含水量做正交试验, 按10%接种量接入菌种, 恒温培养72 h后镜检计数, 结果见表5。

由表5的结果分析可知, 5个因素影响菌体得率的大小关系分别为A>C>D>B>E, 氮源对菌体生长影响最大。各因子的最佳水平组合是A2B1C3D3E4。以玉米粉和麸皮 (占干重的10%) 为基础碳源不考虑互作条件时, 最适固态发酵条件为棉粕为氮源, 碳氮比为21, 基质初始pH值为5.7, 含水量为60%, 培养温度为30 ℃。

3 讨论

不同微生物对营养的要求各不相同, 且对各种培养基成分及配比的要求也不相同。因此在配制培养基时, 应考虑到各种营养成分齐全且合理搭配。碳源、氮源及其比值等都是影响菌株生长的关键因素[4], 由于玉米粉比麸皮更能为酵母菌繁殖提供充足的碳源, 而麸皮则具有更好的通透性, 故试验利用这两种物质的混合物, 为培养基提供优质的基础碳源, 为确定最佳氮源及碳氮比提供基础。

东北豆粕来源广泛, 且其粗蛋白含量高达43%～48%, 并有较平衡的氨基酸组成。棉粕与豆粕相比含有一定的疏松纤维, 通透性较好。尿素则含氮量最多, 且市场价格便宜适中, 可以获得低价高蛋白。而使用硫酸铵作为氮源, 则不仅可以为微生物生长提供氮源, 还可提供硫元素, 有利于微生物的生长繁殖。试验采用豆粕、棉粕、尿素、硫酸铵为基质的氮源, 通过观察酵母在固态基质中的生长情况, 发现有机氮比无机氮更有利于菌体的生长。

试验中, 酵母在发酵24 h后进入对数生长期, 菌体数达到第一峰值, 而在4～5 d出现第二峰值, 可能是由于经稳定期后细胞大量自溶, 部分酵母菌利用自溶物产生二次发酵, 因此主要观察菌体在第3天及第4天的生长情况。酵母菌在碳氮比为23的培养基中能够大量繁殖, 菌体数于第4天达到最高值 (1.206×109个/g) , 当碳氮比高于或低于这个比例时酵母细胞数均下降, 但并不呈依次下降趋势, 而有一定波动。不同氮源、碳氮比的基质中酵母在6 d内的增长优势呈现交替变化, 如以棉粕为氮源的培养基在碳氮比为20时基质中的菌体数要高于在23时, 且高于同等比例时以豆粕为氮源的基质。但经正交试验优化发酵条件后, 得出在碳氮比为21时以棉粕为氮源的基质中酵母菌体数达到1.76×109个/g, 较未优化前提高了45.95%, 这正与上述棉粕的情况相吻合。这说明酵母在不同物料作氮源的培养基中有不同的最适碳氮比。

在试验中发现, 在自然pH值条件下酵母固态发酵极易污染杂菌, 且酵母产量较低。因此, 调整基料的初始pH值、改变培养料的酸度对于培养物中酵母活菌数的增值和抑制杂菌的生长具有实际意义。当基质pH值调至微酸性时, 酵母活菌数呈显著上升趋势, 杂菌得到明显的抑制, 这与崔黎清[5]的研究结果一致;但当进一步提高酸性到pH值为5.0时, 镜检发现酵母活菌数反而降低, 这说明基质维持在一定的酸性环境能够抑制杂菌且保持酵母菌良好的生长, 但酸度过大也会抑制酵母的生长。

4 结论

酿酒酵母固态发酵在24 h后酵母数达到第一峰值, 4～5 d达到第二峰值。

在不同的氮源、碳氮比、培养温度、基质pH值条件下酵母在6 d内呈现交替增长优势变化。以豆粕为氮源时酵母在碳氮比为23的基质中生长最优, 以棉粕为氮源时酵母在碳氮比为20的基质中长势最优。

以玉米粉、麸皮 (占干重的10%) 为基础碳源条件下, 不计互作效应优化的固态发酵条件为棉粕为氮源, 碳氮比为21, 基料含水量为60%, pH值为5.7, 培养温度为30 ℃, 酵母菌体数达1.76×109个/g。

参考文献

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[4]王瑞, 杨晓野, 杨莲茹, 等.不同碳氮源及其比例和培养基初始pH值对少孢节丛孢菌菌丝生长的影响[J].黑龙江畜牧兽医, 2008 (9) :11-13

固态发酵工艺 第6篇

课题组前期对能够降解大豆抗原蛋白的枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis) XZ35株固态发酵豆粕工艺进行了优化[3],通过单因素试验和正交试验研究结果表明,在实验室阶段的最佳发酵条件为: 豆粕粒度2. 0 mm,以小麦麸作为碳源,添加量为2% ,接种量为10% ,料水比为1∶0. 8,发酵温度为40℃ ,发酵时间为3 d。本研究对该最佳工艺条件下发酵的产品进行指标检测,并对该产品进行客观地评定,为枯草芽孢杆菌XZ35株固态发酵豆粕生产奠定基础。

1 材料

1. 1豆粕

粗蛋白含量为45. 56% ,水分为8. 90% ,购自辽宁省锦州市古塔区某大型饲料厂原料部。

1. 2 菌种

枯草芽孢杆菌XZ35株,由辽宁医学院微生物实验室提供,复活后使用; 枯草芽孢杆菌B1菌株,购自辽宁省某生物技术有限公司,为发酵豆粕专用菌种。

1. 3 培养基

豆粕种子液体培养基的配制、豆粕固态培养基的制备均参照参考文献[3]的方法配制。

2 方法

2. 1 枯草芽孢杆菌的活化及种子培养液的制备

将斜面贮藏的菌种接种至装有20 m L的豆粕种子液体培养基中,在37℃下培养24 h,然后按10%接种量分别接入装有100 m L种子培养液的三角瓶中,在37℃下培养24 h。

2. 2 试验设计

采用许云贺等[3]发酵条件将试验分为3组,1组为空白对照组,加入10% 纯化水; 2组为枯草芽孢杆菌B1株对照组,加入10% 枯草芽孢杆菌B1株种子培养液; 3组为试验组,加入10% 枯草芽孢杆菌XZ35株种子培养液。

2. 3 检测方法

大豆抗原蛋白残留率测定: 参照参考文献[4]的方法。抗原蛋白残留率计算公式为:三氯乙酸可溶性氮( TCA - NSI) 含量检测参考GB /T 22492—2008大豆肽粉,用于评定大豆蛋白的降解程度; 粗蛋白含量测定参照GB /T 6432—1994饲料中粗蛋白质的测定方法; 水分含量测定参照GB /T 6435— 2006饲料水分的测定方法; 挥发性盐基氮含量测定 ( 半微量定氮法) 参照SC /T 3032—2007水产品中挥发性盐基氮的测定方法。

3 结果( 见表 1) 与分析

注: 同列数据肩标字母不同表示差异显著( P < 0. 05) ,相同表示差异不显著( P > 0. 05) 。

从表1可以看出: 3组抗原蛋白残留率显著低于1组和2组( P < 0. 05) ; 2组与1组相比,抗原蛋白残留率显著降低( P < 0. 05) 。3组TCA - NSI含量显著高于1组、2组( P < 0. 05) 。2组、3组粗蛋白含量均显著高于1组( P < 0. 05) ,2组、3组之间差异不显著( P > 0. 05) 。水分含量1组、2组、3组差异均不显著( P > 0. 05) 。3组挥发性盐基氮含量显著低于1组、2组( P < 0. 05) 。说明在该发酵工艺参数条件下,枯草芽孢杆菌XZ35株具有较强的抗原蛋白降解能力,能够将豆粕中大分子蛋白降解为小分子的多肽,进而提高豆粕蛋白质的消化率和利用率,提高豆粕在饲料中的应用范围和使用价值。

4 讨论与结论

挥发性盐基氮是考核发酵工艺的重要依据。发酵过程中杂菌生长过多会产生挥发性盐基氮,也有可能是人为地加入铵盐,使氨基酸态氮的含量升高。挥发性盐基氮含量不合格可能与部分生产工艺中发酵条件不当或菌种不纯有关,也可能是掺入了其他含氮量较高的原料补充蛋白。通常发酵豆粕的挥发性盐基氮含量应控制在100 mg /100 g内。

豆粕经过优良菌种发酵处理后,影响其利用的主要抗营养因子大豆抗原蛋白明显减少,同时大分子蛋白降解为小分子肽,益生菌含量明显增加,蛋白质含量明显提高,可以在仔猪和水产饲料中添加使用,提高其使用范围和饲用价值。

经过多年的科学研究与应用试验,豆粕发酵技术日臻成熟,经过发酵,豆粕蛋白质品质得到了显著提高,消化率提高5% ~ 10% ,有利于豆粕蛋白的高效利用,在蛋白质资源相对不足的条件下对我国养殖业可持续发展具有重要意义。目前,发酵豆粕产品质量差异较大,产品稳定性和质量都有待于提高。本研究表明,枯草芽孢杆菌XZ35株发酵豆粕后抗原蛋白残留率为5. 9% ,TCA - NSI含量为7. 24% ,粗蛋白含量为54. 11% ,水分含量为6. 78% ,挥发性盐基氮含量为30. 37 mg /100 g。枯草芽孢杆菌XZ35株可以作为固态发酵豆粕生产专用菌株。

参考文献

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[3]许云贺,苏玉虹,田玉民,等.枯草芽孢杆菌固态发酵豆粕工艺研究[J].饲料研究,2013(3):85-87.

固态发酵豆粕在饲料中的研究应用 第7篇

常见的加工豆粕方法是酶解豆粕和发酵豆粕, 即利用现代生物技术将大豆蛋白通过蛋白酶酶解或微生物发酵降解为可溶性蛋白和小分子多肽的混合物。经过酶解或发酵处理的蛋白由于比传统大豆中蛋白质更易于吸收、低抗原等特点, 被认为是幼龄动物饲料的理想植物蛋白。

酶解豆粕主要用于大豆肽的液态生产。它存在一系列的限制因素, 首先蛋白质水解过程中产生的苦味、臭味无法完全抑制, 尤其是大规模生产中, 降低和脱除水解过程中的苦味和臭味需要很高的成本。较高的价格是限制大豆肽进入市场的主要原因。其次用于水解的酶制剂仅限于食品工业中的常用几种, 单一或混合使用均无法彻底消除水解过程中产生的苦味和臭味。寻找克服水解过程中的苦味的蛋白酶, 任务非常艰巨。且水解度难以控制。

随着固态发酵技术的改进和完善, 固态发酵不仅可以应用于液态生产不能实现的过程, 而且可以弥补液态生产的不足与缺陷。应用现代固体发酵技术能实现大规模生产, 而且其投资规模和生产成本往往要比液态法低, 更重要的是现代固态发酵往往没有影响环境的污染废物产生, 在食品加工业中将发挥越来越重要的作用。固态发酵其中一个重要应用领域就是利用微生物转化农作物及其副产物, 以提高它们的营养价值, 减少对环境的污染。经研究表明, 豆粕经固态发酵则可有效提高蛋白质的生物转化率。

豆粕中的大豆蛋白含量很高, 在43.0%~55.0%之间, 而且其中80.0%以上都是水溶性蛋白。其中赖氨酸2.5%~3.0%、色氨酸0.6%~0.7%、蛋氨酸0.5%~0.7%、胱氨酸0.5%~0.8%、胡萝卜素0.2mg/kg~0.4mg/kg、硫胺素3mg/kg~6mg/kg、核黄素3mg/kg~6mg/kg、烟酸15mg/kg~30mg/kg、胆碱2200mg/kg~2800mg/kg。

1 固态发酵豆粕的工艺流程

微生物发酵豆粕采用生物发酵工程技术, 通过发酵过程中微生物分泌的酶将豆粕中的部分蛋白酶解为分子量3000以上的大豆肽。

2 发酵选用菌种

微生物发酵豆粕常用菌种:乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌等。

季伟等利用产Nisin的乳酸链球菌发酵豆粕。豆粕经乳酸菌发酵后有酸甜芳香的气味, p H值下降, 能有效改善豆粕的适口性, 促进畜禽生长, 同时可以降低抗生素、酸化剂的添加量, 降低饲料成本。

除此之外, 霉菌也经常被研究人员用于固态发酵豆粕的生产, 且常常与其他菌种混合发酵。莫重文等人采用米曲霉和啤酒酵母混合菌株固态发酵法生产发酵豆粕, 利用霉菌产生的多种酶系, 降解其中的纤维素及蛋白质等物质, 利用酵母菌合成菌体蛋白。得到的发酵豆粕中粗蛋白含量可达49.10%, 比原料中增加12.1%。而刘超[7]等用米曲霉菌和酵母菌以麸皮和豆饼粉为主要底物, 30℃混合固态发酵36h。获得了酸性蛋白酶活力达l440U/g、酵母菌数6.29×109个/g、粗蛋白质高达70.56% (其中小肽10.12%) 、还原糖8%的新型蛋白饲料。从而获得一条富含小肽的新型蛋白饲料生产工艺。

由此可知, 用于固态发酵的菌种范围广泛、常见、易于获得。

3 固态发酵生产豆粕过程

发酵过程中分为好氧发酵和厌氧发酵。在发酵前期采用好氧发酵, 促使芽孢杆菌、酵母菌等好氧微生物繁殖生长, 同时芽孢杆菌、酵母菌分泌产生大量酶类、维生素等活性产物促进乳酸菌的生长。后期的厌氧发酵, 促进乳酸菌的增殖, 并产生大量乳酸。微生物在无氧条件下发生强制自溶, 细胞中的胞内酶及其他生物活性成分分泌出来。厌氧发酵时蛋白酶发生酶解反应, 并产生香味物质。

综合好氧发酵和厌氧发酵的优缺点, 将两者结合起来用于发酵豆粕基本可以达到以下指标:发酵酶解产生的小肽占豆粕中粗蛋白含量的30%, 占成品的10%。

发酵豆粕与酶解相比风味得到极大改善, 且产生大量生物活性成分, 但分子量多在5000~10, 000之间, 属于多肽范畴, 离大豆寡肽、小肽的生理活性、易吸收性距离很大, 所以成本相对也比较低。因此越来越多的学者及研究人员研究固态发酵法发酵豆粕。

4 固态发酵豆粕的现状及应用前景

将豆粕通过生物发酵处理后, 使豆粕中的各种抗原成分、抗营养因子被有效降低去除, 豆粕中的蛋白质被分解成大量的植物小肽。这种无抗原的植物小肽吸收率高, 可作为断奶仔猪、幼禽、虾蟹, 尤其是许多高档经济动物的优良蛋白质来源。这一产品的推广应用, 将大大降低饲料工业对鱼粉等动物性饲料的依赖性, 为我国节省大量用于进口鱼粉的外汇, 推动饲料工业的技术进步, 同时产生巨大的经济效益。

由于幼畜 (特别是对于早期断奶的动物) 的消化酶系统尚未发育完全, 对于植物蛋白质的消化能力较弱。而大豆肽中富含许多小肽, 能直接被动物吸收, 而且大豆肽抗原性较低, 幼畜使用后发生过敏反应的概率大大降低。利用多菌种、多温相、多重发酵技术发酵生产的新型发酵豆粕在水产饲料中应用后, 可明显抑制消化道疾病的发生;提高动物机体免疫力, 促进动物生长;同时可大幅度减少疫苗、抗生素等药物使用量;提高水产动物的成活率;减少对环境的污染, 社会效益和生态效益明显。

在早期断奶仔猪饲料中添加大豆肽作为血浆蛋白粉的替代品, 大豆肽可以部分替代中华鳖和鳗鱼人工配合饲料中的白鱼粉, 日均增质量率、饵料系数、特定生长率等无显著性差异。陈萱等 (2005) 用经微生物混菌发酵的豆粕与未经发酵的豆粕依不同比例混合, 连续投喂异育银鲫 (Carassius auratus gibelio) 30d后, 发现随着饲料中发酵豆粕添加量的上升, 供试异育银鲫不仅增重量有所提高, 各项非特异性免疫指标也有所改善。

5 发酵豆粕在饲料中应用推广面临的问题

从当前国内市场来看, 发酵豆粕生产仍处于研究和试制阶段, 国内还没形成大规模商业生产。目前, 其应用推广存在以下主要问题。

5.1 影响大豆肽作用效果因素的研究

虽然很多研究证实了大豆肽能提高畜禽水产动物的生长速度, 改善饲料利用率, 但大豆肽的吸收和利用效果也将受到多种因素的影响。大豆肽的主要成分为小肽, 和其他小肽一样。因此, 大豆肽的消化吸收效果将受到动物因素 (如动物种类、年龄和生理阶段等) 、日粮蛋白质的含量和品质、大豆肽的理化性质和大豆肽的用量等因素的影响。现在, 对影响大豆肽作用效果因素及解决措施, 还没有形成相对深入广泛的研究。对其进一步的研究, 是大豆肽在饲料中推广应用的前提和保障。

5.2 潜在的毒性问题

大豆与发酵大豆产品已食用了几千年, 没有明显的副作用。肽一般在胃肠道蛋白质消化过程中生成, 消化过程释放产生毒性肽的几率是十分微小的, 现尚无出现毒性肽的报道。但是大豆肽的生产涉及生产工艺及其发酵、酶解选用的菌种及酶等, 需要注意其安全性。

6 结论

固态发酵工艺 第8篇

目前, 以醋糟为原料发酵生产蛋白饲料采用的设备是浅盘式固态反应器。浅盘反应器操作简便, 产率较高, 产品均匀。但由于浅盘发酵基质处于静态, 传热传质效果不理想, 发酵基质的厚度有一定限制[3]。而且这类反应器体积过大, 耗费劳动力大, 机械化程度低, 不适宜工业化生产。所以需要开发机械化生产能力强的固态发酵反应器。目前国内外以提出了一些新型结构来解决这类问题。华盛顿大学的Dutch小组研制了转筒反应器是目前研究的热点[4]。在改善固态基质传热传质方面有进展, 但存在的局限也很明显:在发酵过程中, 沿反应器轴向基质的温度梯度依然很大;基质在筒的转动过程中存在沿筒内壁整体滑坡现象。作者在深入研究传统固态发酵反应器的基础上, 提出动态固态发酵反应器新概念, 并设计制造了新型转筒式固态发酵反应器。新型转筒式固态发酵反应器与传统的转筒式反应器不同, 转筒内设置了适合于固态基质混合的螺带搅拌浆和通风系统, 可以克服传统固态反应器的缺点。

混合速度决定反应器内的传热传质分布, 混合时间则是混合速率的主要表征。由于固态基质混合的复杂性, 目前还处于只能对不同的混合设备和物系进行试验研究获取相关数据的水平, 没有通用的设计准则。通过对反应器内混合时间分布的研究, 可以了解反应器内的基质流动状况, 有助于获得最佳的设计和操作形式。

1 试验装置和试验方法

1.1 试验装置

试验装置为自行设计的滚筒式固态发酵反应器, 图1为反应器结构图。反应器筒内径450mm, 长830mm, 与水平轴成15°角放置。本装置选择了适用于固态基质的卧式螺带搅拌浆。这种搅拌器对物料的剪切力小, 能混合附着性凝聚性强的基质特性[5]。它装填率高, 操作面积小, 占用空间小, 操作方便。

装置共有两根螺带搅拌浆, 其旋向相反, 结构参数分别为:螺距S=218mm、螺带宽度W=42mm、螺带半径R=218mm。

本装置对搅拌转数的调节采用1.5KW SE电机及1.5KW富士变频器实现无级调速控制。螺带与器壁的间隙为10mm, 以尽可能消除固态基质在器壁上黏附。

1.2 试验方法

混合试验采用醋糟 (含水率65%) 和0.1mol/LNaOH分别作为主体物料和示踪物。

研究混合时间分布时, 沿反应器轴向等距离设定4个取样点。先将33L主体物料加入反应器并开动搅拌。待系统稳定后, 在反应器进料口加入示踪物Na OH200ml。每隔一定时间间隔从相应的取样点取样。准确称取样品, pH计检测pH值。

2 混合均匀程度的判断

螺带搅拌的混合特性包括向混合与径向混合。对于混合均匀程度的判定, 采用表征混合均匀程度的方差来表示:

式中n为测量点的数目, Xi为第i个测量点的计数值, X为Xi的平均值。方差σ为时间的函数, 随着时间的延长, 标准差越来越小。在固态基质混合中规定方差等于0.04时所需有的时间为混合均匀时的混合时间, 此时认为组分的混合以达到宏观上的均匀。

3 试验结果与分析

3.1 转速影响

由于径向混合时间为秒级, 本试验只研究了轴向混和时间, 考察了一定加料量下搅拌速度对混合时间的影响。图2为填料量为33L时方差随轴向混合时间的变化。由图可见, 随混合时间增大, 方差迅速减小, 但方差达到0.04左右, 会出现上下小波动 (图中未给出) , 表明固态混合与液态混合不同, 很难达到微观尺度的均匀。从图2还可以看出, 搅拌速度对轴向混合时间影响很大, 在搅拌速度为1rpm/min时, 混和时间约27min, 随搅拌速度增大, 混合时间迅速下降。在搅拌速度为15rpm/min时, 只需约6min即达到基质均匀。

3.2 装填量影响

在装料高度很小时, 螺带输入的功率足以使整个基质床层充分湍流, 故不同搅拌速度下的混合时间均不大。但随装料高度增加, 单位体积的基质所获得的功率减少, 基质循环速率降低, 混合时间随之有较大幅度的增大, 特别是在低搅拌速度下。

4 结论

4.1 提出动态固态发酵反应器新概念, 并设计制造了新型转筒式固态发酵反应器。

试验表明采用螺带搅拌浆可以突破传统固态反应器的限制, 改善了固态基质传热传质。

4.2 测定了自制的滚筒式固态反应器宏观混合特性。

试验结果表明了搅拌转速、混合时间及装料量与混合效果之间的关系, 为以醋糟为原料发酵生产蛋白饲料工艺提供试验数据。

参考文献

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