论文题目：中国和尼日利亚棘球绦虫流行株的遗传变异研究
摘要：囊型棘球蚴病（cystic echinococcosis,CE）俗称囊型包虫病,是一种世界范围内分布的人畜共患寄生虫病,在亚洲、南美洲、欧洲和非洲（尤其是北非和东非）高度流行。因受包虫感染的器官被废弃和包虫病患者的治疗费用,CE造成了巨大的经济损失。在人类和家畜,CE主要由细粒棘球绦虫广义种（Echinococcus granulosus sensu lato）引起。基于线粒体（mitochondrial,mt）基因（组）的多态性研究是将一系列遗传关系相近的虫种（虫株）归为“基因型”。线粒体基因遗传差异或多态性影响虫种/基因型对宿主的偏好性及其感染性等。因此,了解某一特定地点寄生宿主的虫种及其基因型的特性,对于理解和预测疫病的发展动态是非常有价值的,并且可以指导有效防控方案的制定。本研究调查了中国西藏自治区（Tibet Autonomous Region,TAR）4个县细粒棘球绦虫广义种的虫种多样性和遗传变异特点,并首次对导致尼日利亚CE的细粒棘球绦虫广义种的虫种/基因型进行了研究与分析。本项研究还筛选了用于棘球绦虫虫种鉴定的微卫星标记,这对进一步分析棘球绦虫种内和种间遗传变异规律有潜在应用价值。首先,研究者在中国西藏和尼日利亚的不同屠宰场从不同中间宿主采集了棘球蚴包囊样品。此外,在尼日利亚的一些地区,采集了终末宿主的粪便样本。利用线粒体基因cox1、nad1、nad2和nad5对包囊样品进行了虫种鉴定,其中对一些虫种的mt全基因组进行了测定与分析。利用贝叶斯推理（MrBayes）程序和马尔可夫链蒙特卡罗（MCMC）抽样方法和MEGA-X软件的最大似然法（maximum likelihood method）,建立了虫种/基因型/单倍型之间的系统发育关系,并评估其后验分布规律,同时,基于不同mt基因和完整的mt基因组数据集在PopART中构建中值连接网络（median-joining networks）。研究分析结果表明,西藏自治区屠宰场的绵羊（n=54）和牦牛（n=31）共计85个包囊分离株样品中83株被鉴定为细粒棘球绦虫狭义种:G1型（n=77）,G3型（n=6）,另外2株为加拿大棘球绦虫G6型。用nad1/nad5基因分析显示,16个突变位点中有9个为简约信息位点,导致15个单倍型,而nad5基因分析显示,17个突变位点中有14个为简约信息位点,共导致14个单倍型。细粒棘球绦虫狭义种（E.granulosus sensu stricto）群体单倍型多样性（Hd）和核苷酸多样性（π）分析显示,nad1的Hd和π分别为0.650和0.00127,nad5的Hd和π分别为0.782和0.00306,总体呈阴性安全系数。较低的群体遗传固定系数(FST)表明绵羊和牦牛分离株之间没有遗传差异。在尼日利亚,通过调查1592个中间宿主和58个终末宿主了解了CE的流行情况,并分析了32株棘球蚴分离株的遗传多样性和变异规律。通过BLAST算法和Bayesian系统发育分析mt基因核苷酸序列表明,32个分离株中有31个为加拿大棘球绦虫（G6/G7）,与之前报道的欧洲、亚洲、北非和东非的G6/G7单倍型的序列一致性为99%～100%。通过对具有代表性的G6/G7样品的mt全基因组测序,得到了全长为13,731 bp的共价封闭的环状DNA分子,总长度比之前报道的G6和G7的mt基因组序列长10 bp以上。此外,基于串联的12个蛋白编码基因序列进行的中接邻接网络分析和最大似然法构建的系统发育树均正确地将它们鉴定为G6基因型。另一方面,nad1、nad5、cox1基因序列的BLAST结果证实了剩余的1个分离株为G1基因型,与GenBank中其它G1序列的相似性为99%～100%。基于nad5基因（680 bp）的中值连接网络分析进一步区分了G1和G3基因型。对终末宿主犬粪DNA检测结果表明,未发现阳性样本。为了探讨微卫星信息标记在虫种遗传多样性和种内变异研究中的应用,作者从Sanger研究院数据库中下载了细粒棘球绦虫（G1）（v3）的完整基因组序列,使用Unipro-UGENE v1.29.0软件中的串联重复序列查找器选项进行了微卫星靶标的筛选。首先,在每个微卫星侧翼区域设计引物,然后用荧光标记的正向引物进行PCR扩增,最后对PCR产物进行毛细管电泳。生成的片段大小和亮度用GeneMapper 4.1确定。在筛选出的6个微卫星中,有2个,即EgSca6Ⅱ（GATA）和EgSca7Ⅱ（GCATG）扩增正确,共扩增出6个和12个等位基因157-198bp和208-262bp,分别产生5个和19个基因型/图谱。然而,微卫星EgSca6-II的多态性信息含量（PIC）在棘球绦虫不同种/基因型之间极低,总体PIC值为0.679,EgSca7-II的PIC值在0.295～0.660之间,总体值PIC为0.811。同样,在其它不同的基因型/虫种中也发现了相似的特征。结果表明,筛选出的标记物并不适用于细粒棘球绦虫种/基因型的鉴定。综上所述,该项研究报道了中国西藏自治区细粒棘球绦虫狭义种复合种群的数量在不断扩大。中国其它地区的绵羊、山羊、牦牛和人类中都有感染加拿大棘球绦虫（G6、G7、G8和G10）的报道。在西藏自治区,仅有G6基因型感染绵羊的报道。本研究中,作者首次从牦牛中检测到G6基因型。因此,作者建议今后在开展流行病学调查和防控工作时,全面调查加拿大棘球绦虫种群（G6、G7、G8和G10）在全国范围内其它潜在中间宿主的感染情况和遗传多样性,以及它们是否也感染人类,以便对CE控制计划做出相应调整。此外,虽然人们普遍认为G1基因型是造成全球CE负担的主要原因,但在尼日利亚,G1基因型不是造成CE的主要原因,这与之前的报告一致,相反,加拿大棘球绦虫G6型可能是引起非洲部分地区CE流行的主要病原。本研究首次揭示了尼日利亚棘球绦虫种群的遗传结构及其对尼日利亚CE控制的意义,并确定了G6基因型是该地区的主要流行株。此外,由于mt基因组的数据集相对于单个基因的遗传信息显示出更大的优势,本研究提供了来自尼日利亚不同中间宿主的具有代表性的G6型加拿大棘球绦虫的mt全基因组序列,这为未来的西非和全球棘球绦虫的遗传群体多样性研究提供了重要依据。此外,虽然本研究和以前报道均证实G6基因型普遍存在于尼日利亚和西非地区,但是,本研究在尼日利亚发现也存在G1基因型,这提示G1这一人兽共患病的病原体种群在尼日利亚和该地区的宿主范围和分布范围可能比以前报道的更为广泛,在今后的工作中有必要在尼日利亚和西非地区进一步深入开展棘球属绦虫遗传多样性的调查。
关键词：西藏自治区;尼日利亚;囊性棘球蚴病;遗传变异;微卫星
学科专业：预防兽医学
摘要
abstract
Abbreviation
CHAPTER Ⅰ General Introduction and Review of Literature
1.1 A brief history of Echinococcus spp.
1.2 Biology and life cycle
1.3 Epidemiology,genetic diversity and population structure
1.4 Cystic echinococcosis in China
1.4.1 CE Prevalence in animals
1.4.2 CE Prevalence in humans
1.4.3 Risk factors
1.4.4 CE control efforts in China
1.5 Cystic echinococcosis in Nigeria
1.5.1 CE Prevalence in animals
1.5.2 CE Prevalence in humans
1.5.3 Risk factors affecting CE prevalence in Nigeria
1.5.4 Bottleneck of cystic echinococcosis research in Nigeria
1.5.5 Statement of problem
1.6 Rationale
Chapter Ⅱ Genetic Diversity of Echinococcus spp. in Tibet Autonomous Region,China
2.1 Introduction
2.2 Materials and methods
2.2.1 Study area
2.2.2 Sample collection and DNA extraction
2.2.3 DNA amplification and sequencing
2.2.4 Molecular and phylogenetic analysis
2.3 Results
2.3.1 Haplotype networks of Echinococcus granulosus(s.s.)
2.3.2 Echinococcus canadensis phylogeny and network analysis
2.4 Discussion
2.5 Conclusion
Chapter Ⅲ Genetic Diversity of Echinococcus spp.in Nigeria
3.1 Introduction
3.2 Materials andmethods
3.2.1 Study area
3.2.2 Parasite material
3.2.3 DNA extraction,amplification,and sequencing of isolates
3.2.4 Molecular analysis
3.2.5 Complete mitochondrial analysis confirmation of the G6 genotype
3.2.6 Sequence assembly and mitochondrial genome annotation
3.2.7 Phylogeny and network construction
3.3 Results
3.3.1 Haplotype network of Echinococcus canadensis(G6/G7)
3.3.2 Neutrality and diversity indices
3.3.3 Phylogenetic analysis
3.3.4 G6 genotype confirmation analysis
3.3.5 Echinococcus granulosus sensu stricto Genotype G1
3.4 Discussion
3.4.1 Complete mitochondrial genome
3.4.2 Echinococcus granulosus sensu stricto genotype G1
3.5 Conclusion
Chapter Ⅳ Development of Microsatellite DNA Markers for Investigating Genetic Variation among Echinococcus spp.
4.1 Introduction
4.2 Materials and methods
4.2.1 Microsatellite screening and selection
4.2.2 Primer design and Characterization of microsatellites
4.2.3 Panel of Echinococcus isolates used for this study
4.3 Results
4.4 Discussion
4.5 Study limitation
4.6 Conclusion
Chapter Ⅴ General Conclusion
References
Appendix
Acknowledgements
Author’s Resume