8-溴-7-甲氧基白杨素 (Br MCh R) 是一种具有多种药理活性的黄酮类化合物, 本研究在前期工作基础上[1], 探讨Br MCh R抑制人肺癌 (A549) 细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用及其可能的分子机制, 为肺癌的新药研究提供实验和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
Br MCh R为黄色晶体, 分子量:347, 分子式:C16H11Br O4, 纯度:99%。5-氮杂-2’-胞嘧啶 (5-Aza-dc) 和0.25%胰蛋白酶购于美国sigma公司;小牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司;甲基亚酚 (DMSO) 购于华美生物技术有限公司;RPMI1640培养基购于美国Gibco公司;DNA Ladder试剂盒购于碧云天生物有限公司;p53基因甲基化、非甲基化引物、PCR扩增试剂盒购于上海生工;甲基化修饰试剂盒购于美国Amresco公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞与细胞培养
人肺腺癌 (A549) 细胞为南华大学肿瘤研究所赠送 (湖南衡阳) 。用含10%小牛血清的RPMI1640, 在37℃、5%CO2混合气体、95%饱和湿度的培养箱内培养。细胞贴壁生长于培养基中, 取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2 DNA琼脂糖凝胶电泳
Br Mch R (0.3, 3.0, 30.0μmol/L) , 5-氮杂-2’-胞嘧啶 (0.3, 3.0, 30.0μmol/L) , 培养基组, 处理A549细胞48h后收集细胞, 按DNA Ladder试剂盒说明书步骤分别提取DNA。提取的DNA置于4℃冰箱过夜, 再将提取的DNA样品5μL与6×buffer1μL混匀后加到4%琼脂糖凝胶 (含溴化乙啶) 中进行电泳, 电泳电压40V, DBT-08凝胶图像分析系统观察并摄影。
1.2.3 PI染色FCM分析
取对数生长期A549细胞, 用含0.1%的小牛血清的培养基处理24h, 细胞周期同步后, 分别加入Br Mch R使终浓度分别为0.3、3.0、30.0μmol/L;5-氮杂-2’-胞嘧终浓度分别为0.3、3.0、30.0μmol/L, 处理48h后收集细胞, 用PBS吹打细胞形成单细胞悬液, 离心, 冷PBS洗2遍, 用4℃的70%乙醇固定24h后, 经终浓度65mg/L的碘化丙啶 (PI) 染色1h, 上流式细胞仪 (美国BD公司, FACS420) 检测细胞凋亡率。
1.2.4 甲基化特异性PCR
提取DNA提取 (采用DNA提取试剂盒) Br Mch R 10.0, 30.0μmol/L, 5-氮杂-2’-胞嘧啶10.0、30.0μmol/L, 培养基组, 处理A549细胞48h后收集细胞, 按DNA Ladder试剂盒说明书步骤分别提取DNA。提取的DNA置于-20℃冰箱过夜。按DNA甲基化修饰试剂盒说明书步骤, 将已提取的DNA样品进行DNA甲基化修饰, 配置20μL反应体系:2X Hotster Mix 10μL, 前向引物1μL, 逆向引物1μL, Bisulfite处理的DNA2μL, 加水补足体积至20μL, 反应条件预变性94℃5m, 变性94℃30s, 退火54℃30s, 延伸72℃30s, 35个循环, 延伸72℃5m。待扩增出产物后用4%琼脂糖 (含溴化乙啶) 进行电泳, 电泳电压50V, DBT-08凝胶图像分析系统观察并摄影。
1.2.5 统计学处理
各组实验数据均用均数±标准差表示, 采用Spss Windows13.0软件One Way ANOVA, 对照组均数与实验组均数比较用LSD法, 多组均数间比较用SNK法, P<0.05为统计学显著性意义标准。
2 结果
2.1 PI染色流式细胞术分析A549细胞凋亡
不同浓度的Br MCh R处理A549细胞48h后, 采用PI染色FCM对细胞进行检测。结果表明:0.3, 3.0和30.0μmol/L的Br MCh R作用于的思路。A549细胞48h后的细胞凋亡率分别为 (2.8±0.60) %、 (5.1±0.11) %、
(19.8±1.74) %, 呈浓度依赖性。其中30.0μmol/L的Br MCh R处理的凋亡率明显高于空白对照组 (P<0.01) 。
2.2 DNA琼脂糖凝胶电泳检测Br MCh R诱导A549细胞凋亡作用
为证实Br MCh R诱导A549细胞凋亡作用, 采用DNA凝胶电泳观察Br MCh R是否引起A549细胞的DNA发生非随机性剪切。结果显示Br MCh R (30.0μmol/L) 处理A549细胞48h, 琼脂糖凝胶电泳出现典型“梯形”DNA条带, 证实Br MCh R具有诱导A549细胞凋亡作用。
2.3 Br MCh R作用A549细胞后p53基因DNA甲基化的变化
MSR扩增后琼脂糖凝胶电泳显示, Br MCh R作用A549细胞前, 甲基化特异引物 (m) 扩增出目的条带, 而非甲基化特异引物 (u) 无条带显示, 提示p53基因DNA存在超甲基化现象。经10.0μmol/L Br MCh R作用A549细胞48h后, 甲基化特异引物 (m) 扩增未见目的条带, 非甲基化特异引物 (u) 扩增出目的条带, 表明A549细胞p53基因在Br MCh R处理后其超甲基化状态被逆转。
3 讨论
Br MCh R是白杨素 (Ch R) 的一种衍生物, 抗肿瘤活性明显优于Ch R[2]。现在普遍认为, 无论药物的靶点何在, 许多化疗药物最终通过诱导肿瘤细胞凋亡而达到治疗目的[3]。为证实Br MCh R是否能诱导A549细胞凋亡, 我们采用DNA凝胶电泳观察Br MCh R是否引起A549细胞的DNA发生非随机性剪切。结果显示Br MCh R处理A549细胞48h, 琼脂糖凝胶电泳出现典型“梯形”DNA条带, 证实Br MCh R具有诱导A549细胞凋亡作用, 其凋亡作用随Br MCh R浓度的增加而增加。Br MCh R30.0μmol/L的细胞凋亡率是 (19.8±1.74) %, 明显高于空白对照组 (P<0.01) 。
然而, Br MCh R诱导A549细胞凋亡的作用机制并未完全阐明。近年来人们发现DNA甲基化与肿瘤的发生密切相关, 抑癌基因的高甲基化可以直接或间接影响基因转录, 使其表达受抑;而低甲基化却可使原癌基因活化, 形成突变热点, 增加染色体的不稳定, 这些都会引起基因表达异常, 导致细胞恶变, 最终形成肿瘤[4~5]。DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式, 它不改变DNA的一级结构, 却在细胞的发育、基因的表达的稳定中起着重要作用。p53抑癌基因与肿瘤发生、生长调控和细胞凋亡关系密切, DNA甲基化严重影响抑癌基因p53活性[6]。目前研究发现p53基因高甲基化与肺癌的发生有关, p53基因低甲基化能降低肺癌的风险[7]。本实验MSP结果显示, 人肺癌A549细胞p53基因呈现超甲基化状态, 在Br MCh R处理后其超甲基化状态被逆转。
综上所述, Br Mch R具有诱导人肺癌A549细胞凋亡的作用, 其分子机制可能是通过逆转P53基因超甲基化而诱导A549细胞凋亡, 发挥抗肿瘤效应。这一研究结果为肺癌的新药开发提供了新
摘要：目的 观察8-溴-7-甲氧基白杨素 (BrMChR) 诱导人肺癌 (A549) 细胞凋亡作用, 并探讨其与P53基因超甲基化的关系。方法 以体外培养的A549细胞为研究对象。PI染色流式细胞术 (FCM) 分析细胞凋亡率;凝胶电泳观察BrMChR诱导基因DNA梯形条带;甲基化特异性PCR检测A549细胞P53基因甲基化状态及BrMChR对P53基因甲基化的影响。结果 PI染色FCM分析显示0.3, 3.0和30.0μmol/L的BrMChR作用于A549细胞48h后, 其凋亡率分别为 (2.8±0.60) %、 (5.1±0.11) %、 (19.8±1.74) %, 其中30.0μmol/L的BrMChR组的凋亡率明显高于空白对照组 (P<0.01) ;琼脂糖凝胶电泳呈现典型“梯形”DNA条带;甲基化特异性PCR显示A549细胞P53基因呈现超甲基化状态, BrMchR能逆转P53基因超甲基化。结论 BrMchR具有诱导A549细胞凋亡的作用, 其作用机制可能与其逆转P53基因超甲基化作用有关。
关键词：肺肿瘤,8-溴-7-甲氧基白杨素,细胞凋亡,P53基因,超甲基化
参考文献
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