豆芽富含维生素、氨基酸、视黄醇、膳食纤维等对人体有益的成分,深受广大消费者喜爱,是老百姓餐桌上的常见蔬菜[1] 。2014年4月18日中央电视台每周质量报告曾报道,部分小作坊式豆芽生产加工企业为牟取经济利益,使用植物生长调节剂4-氯苯氧乙酸钠改变豆芽的生产方法,从而缩短生产周期增加豆芽产量。
4-氯苯氧乙酸钠(CPA-Na)俗称促生灵、番茄灵、防落素,是一种植物生长调节剂。在豆芽生产中,它能使豆芽细胞快速分裂,促进下胚轴粗大,减少根部萌发从而达到加速豆芽生长的目的[2] 。据研究,如果超量摄入4-氯苯氧乙酸钠会使儿童发育早熟、女性生理发生改变、老年人骨质疏松,甚至诱发致癌、致畸的严重后果[3,4] 。鉴于4-氯苯氧乙酸钠对人体的危害,国家食品药品监督管理局、农业部、卫计委三部委于2015年4月13日联合发布豆芽生产经营中禁止使用4-氯苯氧乙酸钠的公告。
目前文献报道4-氯苯氧乙酸钠残留量的检测方法[5,6,7] 在样品预处理上操作步骤繁琐、条件难以控制,重现性较差,耗时较长不利于实验室推广。本研究通过简化前处理方法,旨在建立一种快速、准确、高效测定豆芽中4-氯苯氧乙酸钠残留量的方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
4-氯苯氧乙酸钠标准品(≥98%),购于Adamas Reagent公司;甲醇(色谱醇)、氯化钠、乙醚、盐酸、磷酸二氢钠等均为国产分析纯;超纯水由milli-Q水纯化设备自制;豆芽,来自于市售;酸性氯化钠溶液:于100mL氯化钠溶液(40 g/L)中加入1.0 mL盐酸酸化。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱仪(U3000),配二极管阵列检测器,Thermo公司;高速冷冻离心机,Sartorius公司;氮吹仪,Biotage公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品的前处理
4-氯苯氧乙酸钠极易溶于水,性质稳定。酸化后生成对氯苯氧乙酸,是一种弱有机酸,在水中溶解度低,但易溶于乙醚、乙醇等有机溶剂。利用其化学性质,实验通过向空白样品添加相同浓度4-氯苯氧乙酸浓度,设计了以下3种不同的前处理方法。
方法一[8] :取均质后的样品5 g,加入30.0 m L氢氧化钠溶液(0.01 mol/L),用均质机均质(10000 r/min)混匀3 min,8000 r/min离心10 min,上清液转入50 m L容量瓶中。样品再用少量氢氧化钠溶液重复提取1次,离心后合并上清液,并用氢氧化钠溶液定容至刻度,摇匀。取此液10.0 m L于150 m L分液漏斗中,加盐酸溶液(1∶1)2.0 m L,共用50.0 m L乙醚分3次萃取,每次振摇1 min,合并乙醚层。用5.0 m L氯化钠酸性溶液洗涤,弃去水层,乙醚层用旋转蒸发仪在30℃蒸至近干,用甲醇溶解并定容至1.00 m L,经0.45μm滤膜后,供液相色谱分析。
方法二[9] :取均质后的样品5 g,加入30.0 mL氢氧化钠溶液,用均质机均质(10000 r/min)混匀3 min,8000 r/min离心10 min,上清液转入50 m L容量瓶中。样品再用少量氢氧化钠溶液重复提取1次,离心后合并上清液定容至刻度。取25 m L此溶液,加50%磷酸溶液2.0 m L。慢速过已活化的HLB小柱,用酸性水洗去杂质,再用2.0 m L甲醇洗脱,并定容至2.00 m L。经0.45μm滤膜后,供液相色谱分析。
方法三:取均质后的样品5 g,置于50 m L的离心管中。加入15 m L酸性氯化钠溶液涡旋3 min,并超声提取5 min。再加乙醚15 m L涡旋萃取5 min,然后于8000 r/min离心8 min。取乙醚层。将离心后的样品重复提取1次,合并乙醚层。将乙醚层用氮吹仪吹近干,用甲醇溶解并定容至1.00 m L,经0.45μm微孔滤膜过滤,供液相色谱分析。
1.3.2 色谱条件
色谱柱:Waters Symmetry Shield C18(4.6 mm×250mm,5μm)。流动相:甲醇,0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(35∶75);流速,1.0 m L/min。柱温,30℃。进样量:10μL。波长:228 nm;PDA采集波长光谱检测范围为200~400 nm。
1.3.3 标准系列溶液的配制
精确称取0.1000 g 4-氯苯氧乙酸钠的标准品,置于100 m L棕色容量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀。配制成浓度为1.00 mg/m L的标准储备液;取1.00 m L标准储备液置于10 m L棕色容量瓶中,加甲醇至刻度,配制成100μg/mL标准工作液,分别取0.20,0.50,1.00,2.00,4.00 m L标准工作液置于10 m L棕色容量瓶中,加甲醇至刻度,配制成0.20,0.50,1.00,2.00,4.00μg/m L的标准品溶液,经0.45μm微孔滤膜过滤,置于样品瓶中。按照上述色谱条件进行测定,作峰面积对浓度的标准曲线,求出直线回归方程。
2结果与分析
2.1 样品前处理方法
3种不同的实验方法结果(见表1)表明:
方法一通过碱化生成易溶于水4-氯苯氧乙酸钠,然后再酸化生成4-氯苯氧乙酸,利用其易溶于乙醚的性质进取萃取达到富集4-氯苯氧乙酸的目的。该方法步骤较为繁杂,条件难以控制,重现性较差,耗时最长。
方法二通过固相萃取达到净化浓缩的目的。该方法提取液中杂质明显减少,但提取过程不稳定,提取繁琐、耗时较长,且成本高。
方法三通过直接酸化,有机萃取4-氯苯氧乙酸钠。该方法提取相对完全,而且方便快捷,重现性好;使得在样品量较多的情况下检测更准确、及时。
因此认为,方法三最适合实验室大量豆芽样品中4-氯苯氧乙酸钠的测定。
2.2 色谱分离
在确定的色谱条件下,4-氯苯氧乙酸钠保留时间为13.447 min,其标准品、豆芽空白样品及豆芽空白样品添加标准品色谱图见图1。
2.3 检测器的选择
豆芽成分复杂,因此仅依靠保留时间定性将影响结果的准确性。利用二极管阵列检测器可以采集被测组分的光谱图(图2),从而弥补利用单一紫外波长吸收进行色谱分析过程中色谱峰保留时间定性的不足,增强高效液相色谱法定性分析能力,避免假阳性发生。
2.4 标准曲线与检出限
在本文“1.3.2”色谱条件下,对配制的一系列浓度的4-氯苯氧乙酸钠进行色谱检测。以浓度为横坐标(x)、其相应的峰面积为纵坐标(y)做线性回归,得到的标准曲线方程为y=0.5374x+0.0018,R2=0.9997(见图3)。结果表明,4-氯苯氧乙酸钠的浓度在0.20~10.00μg/m L范围内线性相关性良好。根据实际添加实验测得,该方法最低检出限(S/N=3)为0.02 mg/kg。
2.5 方法的回收率与精密度
称取5.00 g豆芽空白样品,分别向其中添加浓度为1.00μg/m L的4-氯苯氧乙酸钠标准溶液0.50,1.50,3.00 m L。每个添加量做6个平行。“按1.3.1”前处理方法处理过后进行HPLC测定,试验结果及图谱(见表2)。结果显示精密度良好,回收率87.6%~95.2%。因此,证明该处理方法所测得的结果准确可靠,重现性良好。
2.6 样品测定
按建立的方法对菜市场销售豆芽进行检测,总共测定了40份样品。结果有7.5%豆芽样品检出4-氯苯氧乙酸钠,残留量在0.08~0.30 mg/kg。此次监测发现菜市场中销售的豆芽中使用4-氯苯氧乙酸钠较为普遍,应加强监督管理。
3 结论
本研究建立测定豆芽中4-氯苯氧乙酸钠残留的高效液相色谱法。通过简化前处理方法,同时采用光谱图与保留时间共同定性,使结果更加准确可靠。本方法操作简单、方便快捷,适用于大量豆芽样品中4-氯苯氧乙酸钠的测定。
摘要：建立一种快速测定豆芽中4-氯苯氧乙酸钠残留量的高效液相色谱法。以市售的豆芽作为供试样品,用酸性氯化钠溶液提取,经乙醚萃取净化,氮吹浓缩。采用Waters Symmetry Shield C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以甲醇和0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(35∶75)为流动相,色谱检测波长为228 nm,并用二极管阵列检测器记录色谱峰的紫外吸收光谱。结果表明,该方法标准曲线线性关系良好,线性范围为0.20~4.00μg/m L,相关系数0.9997;加标回收率在87.6%~95.2%,最低检出限为0.02 mg/kg。该方法操作简便、快捷、准确可靠。
关键词：豆芽,4-氯苯氧乙酸钠,残留量,高效液相色谱法
参考文献
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