促红细胞生成素 (erythropoietin, EPO) 是人体内调控红系祖细胞的重要造血因子, 能促进骨髓中红系造血祖细胞的增殖、分化及血红蛋白合成。天然存在的EPO药源极为匮乏, 不能满足临床需求。重组人红细胞生成素是利用基因工程技术, 将人的EPO基因转入CHO细胞内分泌表达获得的活性糖蛋白, 用于慢性肾衰竭和癌症化疗产生的贫血。然而, rhEPO制剂在人体内血清循环半衰期仅为4h～8h, 需要经常给药, 增加了患者治疗成本, 严重降低了患者的生活质量。因此如何显著延长rhEPO的半衰期, 已成为当前生物制药领域中一个极具实用价值的研究热点。
1:rhEPO-Fc (reduced) ;2:Protein Marker;3:rhEPO-Fc (non-reduced) ;
本研究采用的rhEPO-Fc融合蛋白制品是将编码人IgG Fc段的基因与编码人EPO的基因片段连接, 并将其克隆至高表达质粒载体中, 用该质粒转染CHO细胞进行分泌表达所得。IgG型的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质, 它们的半衰期可长达21d, 因此rhEPO-Fc融合蛋白的肾小球滤过率减小, 半衰期明显延长, 能更好地应用于临床。将人IgG的Fc区域与其它蛋白质结合形成融合蛋白以延长半衰期已有报道[1], 这种制备融合蛋白的方法已用于一些重要的细胞因子 (如IL-2和IFNa-2a) 和可溶性受体 (如TNF-Rc和IL-5-Rc) [2,3]。
本文对rhEPO-Fc融合蛋白的生物学活性、分子特性及结构进行了研究, 通过优化实验条件, 确定了可控的质量标准, 同时也为人IgG的Fc段修饰的蛋白类药物的研究与开发提供了有效的检测手段和经验。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞
32D1.9细胞为本公司常规传代保存。
1.1.2 试剂
白蛋白国家标准品购自中国药品生物制品检定所;DIG DNA labeling and detection kit购自Roche公司;EPO ELISA kit购自R&D公司, rhEPO-Fc为本公司制备。
1.1.3 仪器
日本岛津LC2010A高效液相色谱仪, Bio-Rad Mini-Ⅱ垂直电泳系统, Bio-Rad PowerPac3000等电聚焦电泳系统, Model550型自动酶标仪, Thermo Biomate 6紫外可见蛋白核酸分析仪。
1.2 方法
1.2.1 体外生物学活性测定
细胞M T T比色法测定效价[4], 采用EPO依赖型细胞32D1.9细胞株, 将32D1.9细胞稀释成3×105悬液后铺96孔板, 将参考品及样品均稀释为0.0006, 0.002, 0.006, 0.02, 0.06, 0.2, 0.6, 2, 6, 20, 60nm, 与细胞等体积分别加入孔中, 设阴性对照, 3 7℃培养, 于第四天每孔加入MTT检测试剂, 酶标仪540/690nm读取吸光度值。酶联免疫法采用R&D公司ELISA kit, 450/600nm处读取吸光度值。
1.2.2 蛋白质含量
按照2010版《中华人民共和国药典》蛋白质测定法第二法 (Lowry法) 进行[5]。
1.2.3 相对分子质量测定
采用还原型S D S-P A G E法, 分离胶12%, 浓缩胶5%, 上样量5μg, 考马斯亮蓝R-250染色。
1.2.4 纯度测定
采用SDS-PAGE法, 上样量10μg, 及高效液相色谱法 (HPLC) (色谱柱:Shim-Pack Diol 300, 流动相:20mM PBS pH7.4溶液;时间:15min;流速:1ml/min;检测波长:280nm;柱温:25℃) 测定。
1.2.5 紫外光吸收光谱分析
按照2010版《中华人民共和国药典》中紫外可见分光光度法进行。
1.2.6 外源性DNA残留量测定
采用固相斑点杂交法, 以DIG标记核酸检测试剂盒测定, 用于探针标记和阳性对照的DNA由生产供试品的CHO细胞提取纯化获得, 应无RNA及寡核苷酸存在。阳性对照DNA点样100pg到0.1pg 5个梯度, 检测样品点样1/10人份剂量, 尼龙膜于120℃干烤30min变性, 40℃杂交过夜。
1.2.7 等电点测定
采用等电聚焦垂直电泳法, 阴极缓冲液2 m MN a O H溶液, 阳极缓冲液1 m M H3PO4溶液, 样品采用透析或者脱盐柱脱盐处理, 上样量2µg以上, 考马斯亮蓝染色。
1.2.8 唾液酸含量测定[6]
按照2010版《中华人民共和国药典》采用间苯二酚显色法, 在酸性条件下, 唾液酸成游离状态, 与间苯二酚反应生成有色化合物后用乙酸丁酯/丁醇 (4∶1) 萃取, 580nm处测定吸光度, 以唾液酸对照品的浓度对其吸光度作直线回归, 计算唾液酸含量。
2 结果
2.1 体外生物学活性测定
本研究对MTT比色法适用于rhEPO-Fc融合蛋白的生物学活性检测进行了方法学验证, 结果显示rhEPO-Fc融合蛋白具有天然EPO的生物学活性, 可呈剂量依赖性地刺激32D1.9细胞的增值, 该方法具有专属性, 比活性可达105IU/mg以上, 样品比活性为参考品的120%;ELISA法测定剂量反应曲线的相关系数为0.9992, 结果与MTT法一致。
2.2 蛋白质含量
以白蛋白国家标准品为标准, 用直线回归法计算样品蛋白浓度为1.58mg/ml。
2.3 相对分子质量
rhEPO-Fc经SDS-PAGE还原法测得的相对分子质量约在59千道尔顿附近, 标准蛋白分子量为200KD, 130KD, 97.4KD, 66.2KD, 43KD, 见图1。
2.4 纯度
SDS-PAGE后扫描测得非还原样品纯度为98.5%, 见图1;HPLC法本文检测了3批样品, 并且每批样品重复检测3次, 保留时间均约为6.99min左右, 纯度为99.659%, 见图2。
2.5 紫外光谱检测
紫外最大吸收峰约为2 7 8 n m, 说明rhEPO经修饰后紫外最大吸收峰没有改变。
2.6 外源性DNA残留量测定
经1%琼脂糖凝胶电泳及分光光度法鉴定阳性对照DNA的纯度:无RNA及寡核苷酸存在, A260/A280比值为1.84。按上述实验方法及条件检测, 显色结果见图3。标记探针检测样品rhEPO-Fc中的DNA残留量小于10pg/mg。
2.7 等电点
经等电聚焦电泳法扫描, 测得rhEPO-F c的等电点落在4.5～6.5范围内, 这与rhEPO一致, 说明结合Fc片段后等电点未改变。
2.8 唾液酸含量测定
1nmol rhEPO-Fc的量 (不包括糖成分量) , 相当于80.1µg, rhEPO-Fc样品的质谱分子量为109KD, 计算得出唾液酸含量为11.92mol/mol蛋白质。
3 结语
rhEPO与人IgG的Fc区域结合形成融合蛋白后, 分子量由原来的30KD增至59KD, 血清循环半衰期显著延长, 因而在临床上能更好地发挥作用。目前还没有检测和控制该制品的方法和质量标准, 我们结合rhEPO的理化和生物学特征, 研究了测定rhEPO-Fc融合蛋白的方法。
体外活性检测中, MTT比色法重复性好且成本较低, 但缺点是周期长。ELISA法操作方便, 特异性高且周期短, 适合于rhEPO-Fc比活性的快速检测, 但成本较高。两种方法检测结果一致, 因此可以相互补充, 针对样品不同的测定需求选择适合的测定方法, 使rhEPO-Fc体外活性的检测更完善、准确、经济可行。
1:IEF standard;2:rhEPO-Fc;
1～5:The concentration of standard DNA were 100, 20, 10, 1, 0.1pg in sequence;6:rhEPO-Fc;
rhEPO-Fc有8个糖基化位点, 其中6个N-糖基化位点和2个O-糖基化位点。有文献报道[7], 如果糖基化程度不高, 虽有体外活性, 但很难有体内活性。若缺乏糖链, rhE PO-Fc融合蛋白在体内迅速被水解而失活。糖基成分主要是唾液酸, 而等电聚焦电泳可以检测N-糖链上唾液酸位点的完整性[8], 因此唾液酸含量检测及等电聚焦电泳是控制rhEPO-Fc融合蛋白的重要指标。
由于生产过程中使用了真核细胞CHO细胞, 而残留的宿主细胞DNA是重组药物中特有的潜在致癌性杂质[9], 因此对rhEPO-Fc融合蛋白中外源性DNA残留量的检测极为重要。地高辛标记核酸探针杂交法与生物素法和同位素法相比具有特异性强, 对操作人员危害性小等优点[10], 因此我们建立了地高辛标记的点杂交法, 用于外源性DNA残留量的检测。
本文所建立的质控方法和标准基于rhEPO-Fc融合蛋白的理化及生物学性质, 简单易行, 经验证, 在准确性、可靠性、重复性等方面能够满足产品质量控制的要求, 已用于本公司rhEPO-Fc融合蛋白产品的检定, 能较好地控制产品的质量, 并且为本公司的生产提供了相应指导。
摘要：目的:本研究采用的rhEPO-Fc融合蛋白是首次将编码人IgG Fc段的基因与编码人EPO的基因片段连接, 并将其克隆至高表达质粒载体中, 用该质粒转染CHO细胞进行分泌表达所得。通过对rhEPO-Fc融合蛋白的质量检验和实验方法参数的选择, 建立rhEPO-Fc融合蛋白的质量标准。方法:采用细胞MTT比色法及Human EPO ELISA试剂盒测定rhEPO-Fc的体外生物学活性, Lowry法测定蛋白含量, SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量, 高效液相色谱法 (HPLC) 测定纯度, 紫外分光光度法测定紫外吸收光谱, 地高辛 (DIG) 标记的核酸探针法测定外源性DNA残留量, 等电聚焦电泳法测定等电点, 间苯二酚显色法测定唾液酸 (SA) 含量。结果:rhEPO-Fc的比活性为1.1×105IU/mg蛋白, 蛋白含量为1.58mg/ml, 相对分子质量约为59000道尔顿, 纯度超过99.0%, 紫外最大吸收峰约在280nm波长处, 外源性DNA残留量小于10pg/mg, 等电点为4.5～6.5, 唾液酸含量为11.92mol/mol蛋白质。结论:所建立的质控方法已用于rhEPO-Fc制品的检定, 可以有效地控制rhEPO-Fc制品的质量。
关键词：rhEPO-Fc,免疫球蛋白Fc段,融合蛋白,质量标准
参考文献
[1] Chamow SM, Ashkenazi A.Immunoa-dhesins:principles and applications.Trends Biotechnol, 1996, 14 (2) :52～60.
[2] Landolfi NF.Chimeric ligand/immu-noglobulin molecules and their uses.US Patent, 1994, 9 (5) :349.
[3] Smith CA, Goodwin RG, BeckmannMP.Tumor necrosis factor-alpha andbeta receptors.US Patent, 2001, 5 (6) :224.
[4] 韩蕾, 韩文跃.MTT比色法与ELISA测定rhEPO体外生物学活性比较[J].细胞与分子免疫学杂志, 2000, 16 (5) :450～453.
[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京, 中国医药科技出版社, 2010.
[6] 邓健, 袁亚莉, 许金生, 等.协同催化-溶剂萃取光度法测定血清中的唾液酸[J].化学分析计量, 2001, 10 (1) :9～10.
[7] Delorme E, Lorenzini T, Giffin J.Roleof glycosylation on the secretion andbiological activity of erythropoietin.Biochemistry, 1992, 31 (41) :9871～9876.
[8] Steve Elliott, Joan Egrie, JeffBrowne, et al.Control of rHuEPO biological activity:The role of carbohydrate1Experimental Hematology, 2004, 32 (12) :1146～1155.
[9] 佘清.第57届WHO生物制品标准化专家委员会会议简况[J].中国药品标准, 2007, 8 (1) :77～79.
[10] Ji X, Lee K, DiPaolo B.Highsensitivityhybridization assay for quantitation ofresidual E.coli DNA[J].Biotechniques, 2002, 32:1162～1167.