丝氨酸是一种非必需氨基酸, 它在脂肪和脂肪酸的新陈代谢及肌肉的生长中发挥着作用, 因为它有助于免疫血球素和抗体的产生, 维持健康的免疫系统也需要丝氨酸。氨基酸的应用范围扩大, 涉及医药、食品、饲料及美容化妆品等领域。目前, 传统氨基酸原料 (蛋白质) 供给严重不足, 如何从角蛋白中寻求新的氨基酸来源成为当务之急。本研究以猪毛为原料, 制备复合氨基酸。
本试验研究混合氨基酸的分离纯化, 以及利用HPLC检测氨基酸的色谱条件。
1 丝氨酸的现状分析
丝氨酸 (简称Ser.) 是一种重要的生化试剂和药剂, 在氨基酸输液和氨基酸胶囊以及多肽合成等方面发展迅速。目前L一丝氨酸生产水平还较低, 在世界氨基酸生产行业中L一丝氨酸是工业化生产难度较大的氨基酸。我国以前大多采用蛋白质水解法提取, 然而分离困难, 始终未能形成生产规模。很多氨基酸除其本身能形成无水物晶体外, 还容易与水一起形成水合物晶体, 存在假多晶型现象[1]。对于存在假多晶型现象的氨基酸, 其不同晶型的形成条件、外观形态以及其转变机理的观测与研究对其结晶生产过程有重要的指导意义。
2 材料与试剂
材料:混合氨基酸浓缩液;HPLC检测氨基酸。
试剂:1 mg/ml氨基酸酸标准溶液;6 mol/l盐酸;茚三酮显色剂:将26.67 g茚三酮溶于1000 m L乙二醇甲醚中, 加入333.33ml醋酸缓冲液, 再加入2.3 ml三氯化钛, 低温保存。
色谱:26 mm i.d.×150 mm不锈钢柱;交换树脂型号:No.2619 (日本公司生产的氨基酸专用树脂) ;柱温:53℃;泵流速:0.225 ml/min;泵压力:8.8 MPa;进样体积:50μl。
3 混合氨基酸的分离实验
L.丝氨酸是一种重要的氨基酸, 其无水L一丝氨酸晶体与一水合L一丝氨酸晶体之间的转变温度为311.15 K左右, 并随着溶液中甲醇含量的提高, 转变温度有所降低2]。
3.1 氨基酸自动分析测定法
取含蛋白20 mg的各种样品于水解管中, 加12 ml的6 mol/l盐酸, 滴入几滴苯酚, 充氮后封管, 置于110℃烘箱中保持22 h, 冷却后经滤纸过滤到50 ml容量瓶中, 用超纯水反复冲洗水解管及滤纸, 最后定容至刻度。取1 ml的样液于蒸发皿中在蒸气浴上蒸干, 加超纯水重复三次, 残留物用0.02mol/l HCl定容至10 ml, 0.45μm滤膜过滤。
3.2 浓缩液除杂试验
目的:除去混合氨基酸浓缩液中的杂质 (如氯化铵、脂状物质或胶体状物质) 和谷氨酸、天门冬氨酸, 以得到粘度小、较澄清的溶液。
加入不同量的硫酸铵, 同没加硫酸铵的浓缩液相比, 看它们在p H或温度改变时有无明显沉淀, 并取样进行检测。除杂后, 取清液1ml, 用蒸馏水稀释100倍, 标为样A.
3.3 真空浓缩, 搅拌, 冷却
目的:除去溶液中一部分的水分, 提高溶液的浓度, 使溶解度较小的物质在缓慢降温过程中以晶体形式析出。
方案:在60~70℃下, 用旋转蒸发器, 浓缩出一定量的水, 以搅拌的形式缓慢降至室温, 观察现象。取清液1ml, 用蒸馏水稀释100倍, 标为样B.
3.4 抽滤, 调p H
目的:除去杂质, 得到澄清的溶液。
用真空泵抽滤, 得到清液, 再调p H为6.0。取清液1ml, 用蒸馏水稀释100倍标为样C.
4 结果分析
4.1 氨基酸自动分析检测结果分析
氨基酸自动分析检测发现, 浓缩液中氨基酸的特征数据表1显示, 混合氨基酸浓缩液中含有16种氨基酸, 其中含量较高的有谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和天门冬氨酸, 而像胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸和精氨酸的含量较低, 在分离制备的过程中可以不予考虑[5];相对来说, 天门冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、丙氨酸和缬氨酸的溶解度较小, 在浓缩过程中会先以晶体的形式析出, 初步判定在分离制备时, 可以根据氨基酸溶解度和等电点的不同, 将其余氨基酸除去, 使溶液中绝大部分为丝氨酸和脯氨酸。
4.2 浓缩液除杂试验
试验一:浓缩液不加硫酸铵, 调p H在冷冻条件下放置一段时间。实验能够看出在不加硫酸铵, 放置在冷冻条件下, 调p H对混合氨基酸浓缩液中各成分的影响不大, 说明单调p H不能达到除杂的目的。
试验二:浓缩液调p H为6.3时, 加入不同量的硫酸铵, 在冷藏条件下放置一段时间后取清液。实验显示, 经真空浓缩, 搅拌, 冷却, 当p H为3.2时, 真空浓缩冷却后, 有晶体析出, 该晶体很可能是门冬氨酸、谷氨酸和氯化铵;抽滤, 调p H, 浓缩液稀释加热抽滤后所得清液分别调p H为6.0, 如果仍旧可以使清液变浑浊, 说明清液中还是存在杂质, 如无则杂质已经很少。
4.3 浓缩液p H=6抽滤
根据出峰时间和混合氨基酸浓缩液各种氨基酸的含量进行分析[5], HPLC检测得出混合氨基酸溶液中不同氨基酸的出峰时间和顺序。依次是:5.329天门冬氨酸, 6.135谷氨酸, 11.987丝氨酸, 12.883甘氨酸, 17.040组氨酸和精氨酸, 17.821苏氨酸, 18.525丙氨酸, 19.526脯氨酸, 27.921缬氨酸。实验中混合氨基酸浓缩液成分含量发现, 将混合溶液p H=6抽滤后 (图1) , 得出浓缩液除杂缬氨酸被分离出来。
混合溶液p H=6, 抽滤实验
结果分析:浓缩液p H=6抽滤后 (图1) , 浓缩液除杂缬氨酸被分离出来, 其他氨基酸出峰时间和含量无明显变化[6]。由表1浓缩液中氨基酸的特征数据表可知缬氨酸等电点为5.97, 将混合液p H调至6.0, 接近缬氨酸的等电点, 缬氨酸在通过调节溶液的p H和抽滤后, 大部分已经析出。
5 结语
5.1 浓缩液除杂后, 得出混合氨基酸溶液中不同氨基酸的出峰时间和顺序。依次是:5.329天门冬氨酸, 6.135谷氨酸, 11.987丝氨酸, 12.883甘氨酸, 17.040组氨酸和精氨酸, 17.821苏氨酸, 18.525丙氨酸, 19.526脯氨酸, 27.921缬氨酸。
5.2 根据氨基酸的等电点和温度, 氨基酸混合液经除杂和浓缩, 能够使缬氨酸析出。
总之, 丝氨酸并没有被完全分离出, 但实验方案和摸索出的HPLC的色谱条件也有一定的参考价值。
摘要：本文以混合氨基酸溶液为研究对象, 分析丝氨酸的现状, 研究混合氨基酸的分离的方法和HPLC检测氨基酸的色谱条件。结果表明, 混合液经除杂后在在6070℃下真空浓缩后抽滤, 调节抽滤液的pH=6抽滤后, 可分离出缬氨酸。HPLC检测得出混合氨基酸溶液中不同氨基酸的出峰时间和顺序。依次是:5.329天门冬氨酸, 6.135谷氨酸, 11.987丝氨酸, 12.883甘氨酸, 17.040组氨酸和精氨酸, 17.821苏氨酸, 18.525丙氨酸, 19.526脯氨酸, 27.921缬氨酸。
关键词：丝氨酸,HPLC,混合氨基酸的分离
参考文献
[1] Craian L.Billiet HAH.Advances in chromatography[J].NewYork E Marcel Dekker, 1986, 2 (4) :62-63.
[2] 张炳荣编译.氨基酸工业大全[M]., 北京:轻工业出版社1991.p32-40.
[3] 大连轻工业学院, 华南理工大学, 郑州轻工业学院等合编.食品分析[M]., 北京:中国轻工业出版社, 2006, p200-409.
[4] 李云飞, 葛克山.食品工程原理[M].北京:中国农业大学出版社, 2002, p712-781.
[5] 邹学满.活性炭脱色对氨基酸分析结果和氨基酸产品得率的影响[J], 氨基酸杂志, 1991, 1 (3) :23-30.
[6] 傅亮, 倪冬姣, 张水华., 氨基酸高效液相色谱分析.仲恺农业技术学院学报[J], 1994, 7 (2) :p12-16.