2006年, 日本Takahashi[1]在既往实验和理论的基础上, 从24个候选基因中筛选出4个胚胎干细胞特异性转录因子 (Oct4、Sox2、cMyc、Klf4) , 并将其导入已分化的小鼠皮肤成纤维细胞, 成功地将其重编程为类似于胚胎干细胞的多能干细胞, 称之为“诱导性多能干细胞”即 (induced pluripotent stem cells, iPSC) 。iPSC是通过基因转染技术将胚胎特异性转录因子 (如, Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4) 导入动物或人的体细胞, 使其直接重构成为胚胎干细胞样的多潜能细胞。2006年以来, 国外有多个实验室通过在人类高度分化细胞中表达外源性干细胞因子而诱导获得了与胚胎干细胞特性十分近似的诱导多能干细胞 (iPS细胞) 系。本实验室通过实验分别构建Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4基因慢病毒表达载体, 为这4个基因在将体细胞诱导为iPS提供前提条件。
1 临床资料
质粒和细胞:慢病毒表达载体穿梭质粒pGC-FU Vector、慢病毒结构质粒p Helper 1.0、慢病毒包膜蛋白质粒p Helper2.0、Oct4基因表达质粒、Sox2基因表达质粒、c-Myc基因表达质粒、Klf4基因表达质粒购自上海吉凯基因化学技术有限公司;293T细胞购自Invitrogen公司;试剂:质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司;Lipofectamine200购自Invitrogen公司;胎牛血清、胰酶和DMEM培养基为Gibco公司的产品, M-MLV逆转录酶和dNTP购自PROMEGA公司, OligodT购自上海生工, Marker购自Fermentas公司;AgeI酶购自NEB公司。
2 方法
2.1 引物设计及合成
根据pGC-FU Vector要求在引物中加入AgeI酶切位点。
M:Marker 5 kb, 3 kb, 2 kb, 1.5 kb, 1 Kb, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp
ACCGGT于PCR扩增Oct4基因F5-CGGGTACCGGTCGCCA CCATGGCGGGACACCTGGC-3R5-CCGGAATTCTCACTTGT CATCGTCATCCTTGTAGTCGTTTGAATGCATGGGAGAGC-3, PCR产物大小:1134bp;同理以下是其余3个基因扩增引物Sox2基因F5-CGGGTACCGGTCGCCACCATGTACAACATGATG GAGACGG-3R5-CCGGAATTCTCACTTGTCATCGTCATCC TTGTAGTCCATGTGTGAGAGGGGCAG-3, PCR产物大小:1005bp;c-Myc, F5-CGGGTACCGGTCGCCACCATGGATTTTTTT CGGGTAGTGGAAAACCAGCAGCCTCCCGCGACGA-3R5-C CGGAATTCTCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCCGCAC AAGAGTTCCGTAGC-3, PCR产物大小:1416bp;Klf4 F 5-CG GGTACCGGTCGCCACCATGGCTGTCAGCGACGC-3R5-CCG GAATTCTCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCAAAATGC CTCTTCATGTGTAA-3, PCR产物大小:1464bp。PCR鉴定目的基因重组连接的阳性克隆菌落, 其中Oct4 F5-CCTGGTGCCG TGAAGCTG-3R5-AGCGTAAAAGGAGCAACATAG-3, PC R产物大小798bp;Sox2 F5-GAGCGCCCTGCAGTACAAC-3R5-AGCGTAAAAGGAGCAACATAG-3, PCR产物大小467Bp;c-Myc, F5-CCACACATCAGCACAACTACG-3R5-AGCGTA AAAGGAGCAACATAG-3, PCR产物大小531bp;Klf4 F5-CA ATTACCCATCCTTCCTGC-3R5-AGCGTAAAAGGAGCAAC ATAG-3, PCR产物大小521bp。上述引物设计与合成均由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。
2.2 重组慢病毒载体质粒的构建
采用PCR技术分别从4个含目的基因表达质粒中扩增目的基因, 用AgeI酶分别酶切载体pGC—FU Vector和上述PCR产物, 琼脂糖电泳分离纯化。将酶切回收载体DNA、酶切回收的PCR产物、In-Fusion交换酶及buffer与ddH20加入反应体系, 于23℃反应15min, 再于42℃反应15min制备克隆交换液, 转化DH5a。PCR鉴定细菌阳性克隆, 分别命名为p GC-FU-Oct4、p GC-FU-Sox2、pGC-FU-c-myc、pGC-FU-Klf4送往上海吉凯基因化学技术公司测序。
2.3 慢病毒包装
制备的各DNA溶液 (pGC-FU-Oct4 20μg, pHelper 1.0载体15μg, pHelper 2.0载体10μg) , 与相应体积的Opti-MEM混合。取100μL Lipofectamine 2000试剂在另一管中与2.4mL Opti-MEM混合。把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合以形成pGC-FU-Oct4 DNA-Lipofectamine 2000复合物。同样按照上述方法制备pGC-FU-Sox2的DNA-Lipofectamine 2000复合物、pGC-FU-c-Myc的DNA-Lipofectamine 2000复合物、pGC-FU-Klf4的DNA-Lipofectamine 2000复合物。DNA-Lipofectamine 2000混合, 室温下温育20min, 混合液转移至293T细胞的培养液中, 于37℃, 5%CO2细胞培养箱中培养。培养8h后倒去含有转染混和物的培养基, 加入含10%血清的细胞培养基25mL, 于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48h。收集293T细胞上清液, 4℃, 4000×g离心10min, 以0.45μm滤器过上清液于40m L超速离心管中。于4℃, 25 000r/min, 离心20min, 冰PBS液重旋病毒沉淀, 于4℃溶解过夜。以10μL每管分装病毒液置于-80℃冰箱中保存。
2.4 慢病毒滴度测定
慢病毒液按10倍梯度稀释为5个浓度后, 分别感染293T细胞, 细胞培养于含有5ug/mL稻瘟菌素 (Blastieidin, BSD) 的DMEM培养液, 约2周左右去除培养液, PBS漂洗后, 结晶紫溶液进行染色, 最后在倒置显微镜下计数细胞克隆数。
3 结果
3.1 4个目的基因克隆PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果 (图1) , 与设计的克隆片断大小一致。
3.2 慢病毒转移质粒的构建及鉴定结果
pGC-FU-Oct4重组质粒阳性克隆PCR产物琼脂糖电泳图 (2A) , PCR片段大小为7 9 8 Bp, 测序结果与Ge n eb a n k中正常NM_002701.4序列一致;pGC-FU-Sox2重组质粒阳性克隆PCR产物琼脂糖电泳图 (2B) , PCR片段大小为467Bp, 测序结果与Genebank中正常NM_003106.2序列一致;pGC-FU-c-Myc重组质粒阳性克隆PCR产物琼脂糖电泳图 (2C) , PCR片段大小为531Bp, 测序结果与Genebank中正常NM_002467.3序列一致;pGC-FU-Klf4重组质粒阳性克隆PCR产物琼脂糖电泳图 (2D) , PCR片段大小为521Bp, 测序结果与Genebank中正常NM_004235.4序列一致。
3.3 重组慢病毒的包装及滴度测定
将获得的病毒液梯度稀释后接种于293T, 经Blastieidin筛选, 约2周左右各转染组均已长出大小不等的细胞克隆, 而对照组则无克隆形成。在倒置显微镜下计数细胞克隆, 并计算出所获重组慢病毒的最终滴度。Oct4基因重组慢病毒、Sox2基因重组慢病毒、c-Myc基因重组慢病毒的滴度均为1×109TU/mL, Klf4基因重组慢病毒的滴度为1.9×109TU/mL。
4 讨论
胚胎干细胞被誉为“万能细胞”, 但一直以来, 获取人体胚胎干细胞必须摧毁胚胎, 这一点颇受非议。iPSC不仅在细胞形态、生长特性、干细胞标志物表达等方面与胚胎干细胞非常相似, 而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与胚胎干细胞几乎完全相同。iPSC的研究, 回避了长期以来围绕人类胚胎使用问题的政治和伦理争论, 并为新药筛选, 药物毒理研究和再生医学等领域提供了广阔的研究和应用前景。
这4个基因, 按其功能不同分为胚胎干细胞特异转录因子Oct4、Sox2, 肿瘤上调基因c-Myc、Klf4。Yamanaka等[1]认为Oct4、Sox2是维持细胞多能性必需的转录因子, c-Myc可以激活下游基因, Klf4则通过抑制P53表达来激活NANOG和其它胚胎干细胞特异性因子表达, 从而提高转化率。Takahashi研究小组[2]去除c-Myc转录因子, 利用慢病毒载体分别携带Oct4、Sox2、Klf4 3个转录因子转染小鼠胚胎成纤维细胞, 同样也获得iPSC, 但此方法的诱导效率约低于4个转录因子共同作用10倍;Huangfu等[3]借助助抑制组蛋白去乙酰基酶活性的小2种转录因子转染人成纤维细胞, 也成功获得ips, 诱导率明显低于3个因子共同作用;Vittorio等[4]用反转录病毒载体只携带Oct4转录因子转染小鼠神经干细胞获得iPSC, 诱导成功率为0.014%, 明显低于2个因子转染效率, 由此可见这个4个基因对于iPSC的最终形成都起着重要的作用。
本研究所采用的慢病毒载体是近年来出现的一种新的基因转移工具, 在多项研究中表现出具有转染分裂期和非分裂期细胞、容载外源目的基因片断大、能够将目的基因整合至靶细胞的染色体在体内长期表达、免疫反应小等独特优点[5]。此外, 研究人员还采用了腺病毒载体法、质粒载体法等方法进行iPSC诱导。Stadffeld等[6]使用腺病毒为载体通过反复转染小鼠肝实质细胞, 诱导产生小鼠iPSC, 对其进行PCR和Southern杂交检测, 没有发现腺病毒的整合。但是这种方法重编程的效率却比逆转录病毒转染要低得多。对于这种低效率, 一种可能的解释是使用腺病毒载体本身使用寿命较短, 不能维系一定的感染力, 转染细胞只能维持3～8d外源基因的表达, 在小鼠成纤维细胞中, 转基因的表达至少需要8d才能产生iPSCs。Okita等[7]建立包含Oct4、Sox2、Klf4的多顺子质粒载体 (polycistroni vector) 和包含c-Myc的质粒载体将小鼠胚胎成纤维细胞诱导为iPSC, 但其诱导率却更低, 说明病毒基因的整合对iPSC克隆形成率有影响。
由于慢病毒载体源于Ⅰ型人免疫缺陷病毒 (HIV-1) 为保证其作为载体的安全性, 我们采用三质粒包装系统, 包括转移质粒、包装质粒及壳蛋白质粒。慢病毒三质粒系统各质粒单独存在时既不能形成病毒颗粒, 也不具备转导能力[8]。转移质粒将HIV3ˊ端LTR中的U3部分切短, 使之丧失启动病毒复制的功能, 同时插入CMV启动子, 成为复制缺陷型病毒载体;包装质粒去除了HIV包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列;壳蛋白质粒用单纯疱疹病毒来源的VSVG基因提供病毒包装所需要的衣壳蛋白, 大大提高了其安全性, 同时包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围, 而且增加了载体的稳定性, 允许通过高速离心对载体进行浓缩, 提高了滴度。病毒的滴度是进行后续实验研究的重要条件, 为了提高慢病毒滴度, 本实验采用共转染包装法, 这种方法[9]与传统方法 (即先将293FT细胞种植于培养板上, 再用DNA一脂质体复合物转染) 相比, 可提高病毒产量3～4倍, 与传统的脂质体2000转染方法的主要区别是:首先制备DNA-脂质体2000复合物, 然后将其加入含生长培养基的板上, 最后加入293FT细胞, 让细胞转染复合物与充分接触, 孵育过夜。结果显示提取含目的基因病毒滴度都较高, 可以达到满足后续实验的要求。本研究旨在构建慢病毒载体转载4个目的基因, 通过运用基因重组、3质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒共转293T细胞包装出高滴度的LV-Oct4、LV-Sox2、LV-c-Myc、LV-Klf4为下一步实验奠定了基础。
摘要：目的 构建Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4基因慢病毒表达载体, 为诱导性多能干细胞研究奠定基础。方法 将Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4基因利用Infusion技术重组构建慢病毒载体穿梭质粒pGC-FU-Oct4、pGC-FU-Sox2、pGC-FU-c-Myc、pGC-FU-Klf4, 经PCR和测序后与与结构质粒pHelper1.0和包膜质粒pHelper2.0在脂质体Lipofectamine2000介导下共转染293T细胞包装生产慢病毒, 浓缩纯化后检测滴度。结果 PCR扩增和测序结果证实成功构建Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4的慢病毒载体并包装慢病毒, 检测Oct4基因重组慢病毒、Sox2基因重组慢病毒、c-Myc基因重组慢病毒的滴度均为1×109TU/mL, Klf4基因重组慢病毒的滴度为1.9×109TU/mL。结论 成功建立重组慢病毒载体的三质粒包装细胞系统。
关键词：Oct4,Sox2,c-Myc,Klf4,慢病毒载体
参考文献
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