重点建设工程论文范文第1篇
油气集输站内的仪表主要是单点的测量控制, 相对于大型石化工厂内复杂联锁的网络式仪表控制点而言, 更重要的是单体仪表设备位置安装的准确性和系统的易操作及易维护性。
仪表安装的一般步骤分为:配合土建预埋铁件→控制室基础槽钢制安→控制柜、操作台安装→单台仪表调校→电缆支架及电缆槽盒的安装→保护管的安装→仪表管道的安装→现场仪表的安装→电缆敷设校接线→仪表系统调试→试车→竣工验收。
2仪表安装的关键工序及重点
2.1施工前准备阶段的关键工序及重点
施工前的准备是安装的重要阶段, 它的工作充分与否, 直接影响施工的进度乃至调试任务的完成, 关键工序包括: (1) 参与好“两个图纸会审”即由建设单位牵头, 以设计为主, 施工单位参加的图纸会审和由施工单位自行组织的图纸会审。 (2) 遵循《自动化仪表工程施工及质量验收规范》编制有针对性、可指导性及可操作性的施工组织设计、各项技术方案和技术交底。 (3) 详细严谨的编制施工图的材料计划。 (4) 和建设单位、监理单位沟通, 准备工程所需的各种质量、过程控制及技术交工资料。
2.2施工阶段的关键工序和重点
施工阶段是安装的实施阶段, 此阶段也是直接影响工程质量和进度的重要阶段, 做好施工的预控及过程质量控制是重点, 关键工序包括: (1) 做好设备进场的检验, 与建设单位、监理单位共同开箱检查的初验及对仪表单体设备的校验。 (2) 严格按照图纸配合工艺进行一次取源点的标定和取源部件的安装, 重点注意取源点开孔的位置、方向应符合规范要求 (。3) 与土建交付中控室后进行仪表盘柜的安装, 包括DCS控制盘及各仪表电源盘的安装 (。4) 仪表管路的敷设, 严格按照规范要求敷设测量管路、信号管路、动力管路、气源管路及伴热管路, 注意管口的打磨及密封。 (5) 现场仪表设备的安装, 应遵循避开振动源、磁场源、干扰源及腐蚀场所, 便于维护检修、整齐美观, 重点注意仪表设备安装后的保护工作。 (6) 现场仪表配线, 包括接地线、电缆敷设、保护管、接线箱、电缆桥架、控制室仪表安装和配校线。重点注意, 若电缆为直埋电缆, 电缆沟的深度应按图纸设计要求, 且不少于700mm深, 信号电缆和电源电缆应分沟敷设。 (7) 仪表管路的吹扫和试压, 现场仪表安装、管路敷设完毕后, 配合工艺管道进行吹扫试压, 应注意的是吹扫时应该将管路与仪表设备连接部分堵住或将仪表设备取下, 防止吹扫时损坏仪表设备, 对高温高压的仪表管路需进行单独试压 (。8) 在仪表投入使用前, 必须进行单体调试, 并配合工艺进行单体试运, 需注意的是对仪表设备送电前应仔细检查核对供电电源, 防止仪表电源错接造成烧表的后果。 (9) 二次联校在安装基本结束时进行, 在三查四定检查完毕后, 确认是否图纸和设计变更上的工程完成及存在的质量安全隐患, 整改完毕后, 控制室进行二次联校、保护试验, 包括报警连锁回路。需注意联锁回路参数应符合设计给定值, 动作应达到预期效果的要求。
2.3试投运阶段的关键工序和重点
此阶段先进行单体试运, 由施工单位负责, 建设、监理单位参加, 应重点注意泵的进、出口压力, 轴承温度指示等, 对可手自动切换的设备均应进行手自动试运。在此阶段重点检查各就地/远传仪表设备指示/显示是否准确灵敏, 各仪表设备与取源部件连接处是否紧密, 无泄漏。联动试运是在单体试运合格的基础上进行, 这个阶段, 由建设单位组织人员操作, 施工单位配合指导, 原则上所有自控系统都要投入运行, 除个别液位系统外, 全部的流量、液位、压力、温度参数仪表都投入运行。按规定, 联运仪表系统正常运行72小时后, 施工单位移交给建设单位。联运合格后, 即具备正式生产的条件。
3站内仪表运行维护的建议
(1) 相关人员应尽快熟悉站内仪表、工艺流程、电脑控制界面的操作方法及简单问题的处理办法, 以免因不熟悉造成仪表设备的损坏, 严重则可造成安全生产事故 (。2) 通过一段时间的系统运行, 定期对各仪表进行调校, 保证仪表的准确计量, 远传仪表与就地仪表数据对比, 适当修改仪表设备的参数, 以提高生产数据计量的准确性和可靠性 (。3) 定期检查防爆、户外区域内仪表设备、接线箱等裸露部位是否密封严实, 防止不安全因素的发生和雨雪天气对线路和设备的损伤。 (4) 定期检查站内仪表设备、管路、气路的连接处是否有漏点, 若有应及时处理。 (5) 对站内工艺流程、报警系统、监控系统中所涉及的仪表设备出现的故障及问题应及时与厂家或施工单位沟通, 给予技术指导, 必要时应到现场予以解决。
4结语
仪表安装主要依附工艺系统, 因此, 除应熟悉本专业图纸外, 还应查阅工艺流程图纸。对集输站仪表安装应做到:仪表设备的数量、规格清楚;仪表电缆、仪表管路敷设路径清晰;仪表设备安装位置准确可靠、符合规范并易于观察和维护;在施工过程中与监理单位、建设单位、厂家及其它相关专业及时沟通, 默契配合。
摘要：对于片区分散、地形复杂、难以集中监控管理的油气井, 集输站的建设有效提升了生产运行信息化的集中监控和管理。仪表安装质量对生产运行的数据、监控、报警、分析有着重大的意义。本文以延长石油永宁采油厂宜西沟站为代表论述典型仪表在不同集输站内安装的施工步骤, 仪表施工的关键工序, 仪表安装过程中的重点以及对站内仪表设备运行维护的建议。
关键词：油气集输工程,仪表安装步骤,仪表安装关键工序及重点,仪表运行维护建议
参考文献
[1] 自动化仪表工程施工及质量验收规范GB50093~2013[Z].2013.
[2] 石油化工仪表工程施工技术规程SHT3521~2007[Z].2007.
重点建设工程论文范文第2篇
一、社会经济方面
2006年至2010年5年，各年完成地区生产总值分别达到2.5亿元、2.87亿元、3.48亿元、4.01亿元，同比增长11.6%、14.8%、21.2%、15.2%，其中农业总产值分别完成了3512万元、4028万元、5013万元、5526万元，同比增长16.7%、14.6%、24.5%、10.2%，工业总产值分别完成2.01亿元、2.28亿元、2.75亿元、3.15亿元，同比增长9.8%、13.4%、20.6%、14.5%，第三产业总产值分别完成1501万元、1713万元、2212万元、2933万元，同比增长25.1%、14.1%、29.1%、32.6%，
二、城镇规划方面
为了正确指导县溪镇的建设和发展，合理地规范县溪镇的建设行为，满足县溪镇健康持续的发展建设要求，由湖南省建筑科学研究院编制的《通道侗族自治县县溪镇总体规划》对县溪镇未来20年的建设做了详细的规划。
1、2009年1月，县溪镇政府委托湖南省建筑科学研究院对县溪镇镇进行总体规划编制。
2、2009年9月1日镇政府接到规划单位的规划蓝本;次日上午马上召开党委政府会研究规划的具体情况，提出其中存在的不足和意见、建议，下午召集县乡人大代表、政协委员、镇区相关村(居)书记和相关部门负责人开会介绍规划的具体情况以及对规划的意见和建议。
3、2010年3月29日，政府再次召集县乡人大代表、政协委员、镇区村书记和相关部门负责人研究规划的问题，要求大家再多提提有用的建议，为规划提出了很好的意见和建议。该规划的通过创造了通道县建制镇总体规划的先河，为今后乡镇规划的制定提供了很好的范例;为县溪镇今后20年的发展提供了依据和法律保障。该规划把我镇定位为通道县的工业重镇、交通枢纽和红色旅游重镇，为我县做好两篇文章的格局奠定了坚实的基础，为今后我镇的发展提供了良好的发展平台。
4、 3月29日，县溪镇人大主席团召集部分县、镇人大代表，征求对该镇小城镇建设规划的意见。县人大副主任李时学，县人大、统战指挥部成员参加了会议。会议听取了镇政府有关小城镇总体规划纲要和工业发展区、行政商住区、红色旅游景点区、铁路贮运区四大功能板块筹建情况说明，并就规划方案的科学性、重大工程项目建设等问题展开了深入讨论。代表们建议小城镇要高起点规划，要考虑好与靖州、黎平的接轨，接受靖州、黎平的辐射;红色旅游景点区的建设要充分利用恭城书院这个品牌进行整体考虑，建设过程中充分发挥社会力量作用;小城镇建设既要重视硬件建设，也要考虑软件即群众的素质提升的问题等等。代表们还就如何
推进旧镇改造、推进商贸三产发展等内容进行了深入探讨，提出了许多宝贵的意见和建议。
5、在4月20日县溪镇第十三届人民代表大会第四次会议上，全票顺利通过了《县溪镇总体规划(2009-2030)》(以下简称《规划》)。县人大副主任李时学参加了会议并针对规划提出了操作性很强的意见和建议。
四、城镇建设方面
1、道路建设：镇辖区路网基本建成，道路硬化率达到90%，形成了以正街、火车站路为主干道以市场路、志诚路、老街为次干道的路网体系，紧抓县委县政府大力发展县溪镇红色旅游的机遇，将对现有道路进行拓宽改造。
2、给水排水：镇区实现统一供水，供水普及率达到95%，合格的水压、水量、水质保证了居民正常生产生活的有效开展;排水系统畅通且运转正常，无大面积积水情况发生。
3、电力电信：截至2010年全镇各村均实现通电、通邮、通电话，有线电视普及率达到95%，移动电话普及率达到80%。
4、燃气：镇辖区有标准液化气站2家，60%的居民均以燃气为主要燃料。
5、房屋建设：镇区建有影院小区和农行小区两个标准住宅小区，人均住房建筑面积达到30平方米，农行小区双坡披檐构造是典型的侗族建筑风格。
6、园林绿化：县溪镇做为一个山区小城镇四面环山，渠水河穿城而过，山清水秀，城区绿化率达到30%以上，人均公共绿地面积6.5平方米。
7、空间特色：抓亮化工程，投入10万元对损坏了的街道路灯进行更新维修，亮化了城镇环境，
8、环保环卫：县溪镇垃圾处理场位于恭江村6组龙尾巴壕，面积约为10亩，垃圾采用焚烧、填埋方式进行处理，现有堆存量约为2500吨，县溪镇城区日产生垃圾近5吨，垃圾场还可以服务28年。垃圾处理场周围环境状况为：东靠山坎，南靠水田坎，西靠山坎，北靠进屯里村分道。镇区汽车站建有垃圾中转站1座，容量为10立方米;镇区设置垃圾池7个，每个垃圾池容量为5立方米;街道两旁设有果皮箱50余个，此外给每个临街店面发放了垃圾桶，为300余个;垃圾一天两运。
9、防灾减灾：，投入2.5万元更换了年久失修的消防栓，并配备了800米的消防水带，
四、城镇管理
县溪镇党委政府以县委县政府提出的做好“两篇文章”开发小城镇建设为契机，加强队伍建设，严格打造一支特别能吃苦、特别能战斗、特别有作为的高素质城管执法队伍，集中整治城区马路市场的“六乱”现象，规范城区主干道车辆停放秩序，彻底改变县溪城区脏乱差现象，给市民创造环境优美、秩序井然、干净卫生的人居环境。
(一)城管中队职责：根据建设部《城建监察》规定：
1、实施城市规划方面的监察;
2、实施城市市政工程 设施方面的监察;
3、实施城市市容环境卫生方面的监察;
4、实施城市市容环境卫生方面的监察;
5、城区交通秩序的管理;
6、城区环保、水域污染环境等方面的执法;
7、人民政府委托的其他事项。
(二)环卫工作：城区(包括河西主干道、书院路等近3万平方米的清扫保洁和垃圾清运任务，彻底清除卫生死角，
建立门前三包落实制度，加大防尘降尘力度，切实改变城市环境卫生。
(三)岗位设置。
1、城管中队：中队长：杨绍平;副中队长：莫进伟(抓业务)、张碧宏(抓市政设施)、龙章健(抓城区环卫工作)
2、中队上班实行两班制，城管队员和协管员组合上班，严格按规章制度管理
3、环卫分段包干清扫保洁，即河西、大桥—新华书店、新华书店—城管岗亭、城管岗亭—火车站。
重点建设工程论文范文第3篇
一、工程进展情况
(一)270省道邳州东南绕越公路工程。该工程系徐州市2013年度“三重一大”项目，由路基路面、张楼京杭运河特大桥和陇海
铁路上跨立交桥3个部分组成，总投资9.1亿元。
绕越公路路基路面工程。全长24.7公里，一级公路，设计行车速度100公里/时，路面宽26米，SBS沥青混凝土路面，路桥同宽。其中，陇海大道至古栗园段3.6公里路面宽42米，工程总投资5.7亿元。目前，工程建设的各项行政审批手续办理完毕，具备开工建设条件。按照市领导的安排，征地、拆迁、清障评估工作在1月份完成，沿线新河、张楼、炮车、陈楼4个镇各类补偿款1.078亿元。
京杭运河张楼特大桥工程。大桥长2147.2米，宽26米，通航主跨105米，工程总投资约2.4亿元。工程于2011年8月26日开工建设，目前已完成下部结构工程量的65%，通航主桥墩水下工程已全部结束，完成工程投资9300万元，占总投资的39%，计划今年11月底完成主桥合龙，明年5月1日建成通车。工程建设所需2.4亿元资金由我局融资解决。
陇海铁路上跨立交桥工程。陇海铁路上跨立交桥是我市境内唯一一座跨铁路大桥，长742米，宽26米，工程总投资9100万元。大桥施工图昨天刚刚通过上海铁路局审查，目前各项行政审批手续完成，具备开工建设条件，拟委托上海铁路局安徽上铁公司代建，计划5月份完成招投标，7月份开工建设，明年10月1日建成通车。工程建设所需9100万元资金由我局融资解决。
(二)250与251省道连接线工程。全长12.81公里，二级公路，路基宽15米，路面宽12米，设计行车速度80公里/ 时，SBS混凝土路面，工程总投资约1亿元。该项目工期较紧，相关行政审批手续正在办理中，经请示徐州市交通运输局同意，可以先行开工建设，尽快完善各项审批手续。按照市领导的要求，征地、拆迁、清障评估工作结束，补偿费用正在统计中。计划4-6月份完成招投标和清障工作，7月份开工建设，明年7月1日前建成通车。
(三)世纪大道东延工程。长2.48公里，一级公路，快车道宽21米，两侧慢车道宽各7米，SBS混凝土路面，建设总投资约3000万元。
二、工程建设融资情况
今年交通建设任务十分繁重，投资规模再创新高，各项重点工程和民生工程建设资金13亿元，其中270省道邳州东南绕越公路、张楼京杭运河特大桥、陇海铁路上跨立交桥、250与251省道连接线、世纪大道东延工程等重点工程需要9.5亿元。经过多方努力，目前融资工作取得重大进展。
(一)融资进展情况。近日，与福建华通路桥建设有限公司达成道路建设+房地开发协议，合作协议计划于3月18日签订，由福建华通负责270省道邳州东南绕越公路、250与251省道连接线、世纪大道东延工程的建设，市政府挂牌出让两宗土地给华通公司用于开发房地产，协议总价款约7亿元。其中，东南绕越公路工程建设投资为5.7亿元，建安费3.83亿元，征地、拆迁、清障等前期费用1.49亿元。250与251省道连接线工程建设投资约1亿元，建安费5500万元，征地、拆迁、清障等前期费用4500万元;世纪大道东延工程征地、拆迁、清障不列入协议中，只计算建安费3000万元。
经商定，市政府与福建华通公司签订合作协议20日内华通公司在邳州完成新公司注册，注册后7日内汇5000万到双方共管账户用于征地、拆迁、清障。市政府与华通公司签订协议后60日内，完成270省道东南绕越公路招投标工作，市交通投资有限公司与华通公司签订《道路施工总承包合同》，约定技术标准、质量目标、工期、安全、环保、资金支付方式、验收等内容。合同签订30日内，邳州市政府保证按时挂牌出让第一块土地，华通公司在摘牌7日内支付土地出让金的50%，计1.8亿元(实际到账1.3亿元)到双方共管账户用于270省道、250与251省道连接线征地、拆迁、清障及建设。之后按工程进度每完成3000万元，华通公司汇一次款到共管账户，支付施工、监理单位。
重点建设工程论文范文第4篇
开放课题管理条例
(2008年制订)
一、为了规范管理，明确责任与义务和经费使用范围，特制定本条例。
二、凡经审批通过的课题经费只能用于在本实验室内进行开放课题的研究工作。
三、课题研究成果，如在国内外期刊或在学术会议上发表研究论文，应将“南京
工业大学材料化学工程国家重点实验室 210009 (State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, China)”列为作者单位之一，并注明“南京工业大学材料化学工程国家重点实验室开放课题基金资助项目，supported by the State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering”，中文论文请向南京工业大学材料化学工程国家重点实验室报送期刊封面、目录页和论文正文的复印件，英文论文可传送期刊发给作者的reprint电子文档，以便备案;如申请专利，专利权归申请人单位所有，如有本实验室合作者，南京工业大学大学应同为专利权人。
四、获本实验室资助的研究课题在实验研究工作结束时，需向实验室递交《开放
课题结题报告》，进展良好者，经实验室学术委员会同意，可给予持续支持。
五、经费开支的范围限于如下用途：
1. 在本实验室中工作期间所需要的试验材料费、测试费、专用小型仪器设
备购置费、学术资料费等。
2. 以本实验室为第一署名单位的论文参加国内外学术会议的会议费(1人次)
和论文版面费。
3. 开发课题负责人或课题参加者来实验室工作的差旅费、住宿费等。 4. 研究工作中用实验室资助经费购置、加工的仪器设备和装置归实验室所
有。
六、重点实验室可为来实验室工作的课题执行人提供实验条件。
七、课题负责人如果不按时开展研究计划，或者获资助的研究课题在实验中与研
重点建设工程论文范文第5篇
08生工2班
黄永平
0820020044
细胞工程考点总结
名词解释：
细胞工程：是指以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的 地利用或改造生物遗传特性，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性 科学技术。
细胞周期：通常将通过细胞分裂产生的新细胞的生长开始到下一次细胞分裂形成子细 胞结束为止所经历的过程称为细胞周期。
细胞全能性：细胞具有该个体全部遗传的可能性，在一定条件下如受精卵一样，有发育成完整个体的固有潜在能力。两层含义：细胞无论是体细胞还是生殖细胞，均具有该物种全部的遗传信息;每个细胞均具有发育成完整个体的潜在能力。
细胞分化：指细胞在形态、结构和功能上发生差异的过程，，包括时间上和空间上的分化 。实质是基因的差异表达。
细胞脱分化：又称去分化，是指分化的细胞失去特有的结构和功能变成具有未分化细胞特性的过程，即分化细胞在适当的条件下转变为胚性状态而重新获得分裂能力的过程。可采用人工诱导技术诱导体细胞脱分化。
细胞再分化：指在离体条件下，无序生长的脱分化细胞在适当的条件下重新进入有序生长和分化状态的过程。事实上是基因选择性表达与修饰的人工调控的过程。
植物组织培养：是将植物器官，组织，细胞和原生质体等外植体在离体无菌条件下培养在人工培养基上，在适当的条件下诱发长成完整植株的一种技术。
植物激素：是植物自然状态下产生的对生长发育有显著作用的微量有机物，包括生长素家族、细胞分裂素家族、赤霉素、乙烯和脱落酸。
愈伤组织：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞。植物组培中，指脱分化后的细胞经过细胞分裂，产生无组织结构，无明显极性的松散的细胞团。
体细胞胚：又叫胚状体，是指离体条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。其发生途径是指体细胞在离体培养的过程中经历了胚胎发育过程，起源于非合子细胞。发生实质是细胞再分化。
人工种子：含义为将植物离体培养产生的体细胞胚或芽包埋在含有营养成分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，在适宜条件下发芽出苗的颗粒体，即人工种子。
细胞核移植：是一种利用显微镜操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟细胞内的技术。用该方法所得到的动物为核质杂种。
胚胎分割：是指借助显微操作仪切割早期胚胎成多等份，再移植给受体，从而制造同卵多仔后代的技术，是一种广义上的动物克隆技术。
性别控制：是通过人工操作手段繁殖所需要性别后代的一门技术，其方法主要包括受精前控制、胚胎移植前控制。
试管动物：又叫体外受精动物，是指将供体的精子与卵子在体外受精，体外培养胚胎发育到一定阶段，通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。
试管婴儿：指将卵子与精子在体外受精，培养发育成早期胚胎再植回母体子宫内发育出生的婴儿也就是采用体外受精联合胚胎移植技术培育的婴儿。
细胞重组：是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，在体外进行重新装配成为具有生物活性的细胞的一种技术。
细胞拆和：把细胞质与细胞核分离开来，然后把不同来源的细胞质和细胞核相互结合，形成核质杂交细胞。
第1页，共9页 广州大学生命科学学院
08生工2班
黄永平
0820020044 细胞融合：又叫体细胞杂交，是指将不同来源的原生质体融合并使之分化再生，形成新物种或新品种的技术。
体细胞杂交：是指将不同来源的体细胞融合并使之分化再生、形成新品种的技术。 胚胎嵌合：又称胚胎融合，是将两枚或两枚以上的胚胎(同种或异种动物)的部分或全部细胞混合在一起，使之发育成一个胚胎，然后移植到受体内继续发育成嵌合体后代的技术。 雌核发育：或孤雌生殖，精核进入卵细胞后未与卵核融合而退化，卵核未经受精而单独发育成单倍体。远缘杂交中有时会出现此种现象。
植物细胞培养：在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增殖，获得大量细胞群体的一种技术。
细胞株：通过克隆化培养从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊遗传、生化性质或特异性标记的细胞群。
细胞系：是由原代培养经传代培养纯化，获得的能在体外生存的细胞群体，第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。
单克隆抗体：是指经过免疫哺乳类动物单一的B淋巴细胞，要以分泌单一性抗体，这种抗体具有特异性和同质性。
干细胞：同时具有自我更新以及产生分化细胞的增殖性细胞。
组织工程：是利用生命科学、医学、工程学的原理与技术，利用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或再生的一门技术。
细胞凋亡：也叫程序性细胞死亡，是机体维持环境稳定、有基因控制的细胞自主的有序性死亡。与细胞增殖、分化一样，都是正常的生理现象。这种细胞行为在数量控制和形态塑造中具有的意义。P27 染色体工程：按设计有计划削减、添加和代换同种或异种染色体从而达到定向改变遗传特性和选育新品种的一种技术。
胚胎移植：又称受精卵移植，是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。
胚胎工程：是按照一定的设计，有计划地消减、添加或替换同种或异种染色体从而达到定向改变遗传特性和选育新品种的一种技术。
简答题或问答题：
1.细胞工程的应用：
细胞工程的应用领域非常广泛，主要包括：优质植物快速培育与繁殖;动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种;利用动植物细胞培养生产活性产物、药物;新型动植物品种的培育;供医学器官修复或移植的组织工程;转基因动植物的生物反应器工程;珍稀动植物资源的保存与保护;在遗传学、发育学等领域的理论研究;在能源、环境保护等领域的应用。
2.为一农业生物技术企业设计一用于花卉快速繁殖组培工厂?画简图，并说明各室要求。
实验室一般由准备室、无菌间、操作间、培养室、分析室等几部分组成，其首要要求是工作环境和条件必须保证无微生物污染，环境清洁，各室的要求如下;
准备室;一般要与其他室分割开来，需放置药品柜、器械柜、灭菌锅、过滤除菌器、天平，加热设备等;要求宽敞明亮，通风条件好。
无菌间：进行无菌操作。要求封闭性好，无尘、干燥清洁，大小要合适，没有死角，能较长
第2页，共9页 广州大学生命科学学院
08生工2班
黄永平
0820020044 时间保持无菌保持清洁，应防止空气对流，墙面和地面要求光滑，密封、安装滑门，定期用甲醛和高锰酸钾产生的蒸汽消毒，使用前开紫外光灯20min，更衣换鞋。严格的应包括更衣间、缓冲间和操作间3部分，缓冲间处于两者间 操作间：
培养室：对离体材料进行控制培养，能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，应保持干燥和清洁，一般设置在室内较少走动的内侧，需放置摇床、二氧化碳培养箱、生化培养箱光照培养箱、人工气候箱培养架等; 分析室：
3.分析比较细胞培养不同操作方式的优缺点。
分批式培养方式的优点有操作简单，培养周期短，能直观反映细胞生长代谢过程，生产规模放大比较容易，其缺点有不能控制底物浓度、细胞容易老化、生长周期短、效率低等;流加式培养的优点有可合理充足补充营养、减少产物反馈抑制、排除有害代谢物积累对细胞的损伤及细胞不易老化，另外还能避免一次性投料过多，改善培养液流体性质，延长指数生长期，其缺点是操作较麻烦，受生物反应器容积的限制等;半连续式培养能使细胞持续指数生长，可多次收获并且操作简便，生产效率高，其缺点是菌种易老化;连续式培养可使细胞在恒定状态下生长，细胞生长速率可基本保持不变，持续指数增长，但其缺点是收获细胞浓度不高、细胞分裂快、易变异、易污染等;灌流式培养可维持较高的细胞密度，使细胞处于较稳定的营养环境中，有害代谢废物积累低，反应速率易控制，培养周期长，目标产品回收率高，其缺点是仪器设备要求较高，操作较复杂等。
4.植物快速繁殖的技术路线：( P81 ) 1)采集材料：①受精卵/②发育中的分生组织细胞(分生组织/根尖/嫩茎/幼叶/花等)/③雌雄配子及单倍体细胞;2)消毒材料：①自来水洗净然后用无菌纱布吸干水分，切成小块/②无菌环境中用70%酒精浸泡30~60秒/③材料移入漂白粉饱和液或0.01%升汞(HgCl2)水中消毒10min/④无菌水冲洗三四次;3)制备外植体：无菌环境下，用无菌刀剥去材料的鳞片、嫩枝的外皮或种皮胚乳(叶片不需)，切成0.2~0.5cm厚的小片，操作中不可用手触碰;4)接种和培养：①接种：无菌环境下将切好的外植体立即接种在培养基上，每瓶4~10个②封口：接种后瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口③温度：培养基大多应保持在25℃左右，但要因花卉种类及材料部位不同而区别对待④增殖：在新梢等形成后需要继代培养;5)根的诱导：继代培养形成的不定芽和侧芽一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养，一个月后即可获得健壮根系;6)组培苗的练苗移植：试管苗进入自然环境前必须进行炼苗，一般先将培养容器打开在室内自然光照3天，然后取出小苗，自来水洗净根须，栽入消毒过的基质，移植前适当遮阴，加强水分管理，保持较高的湿度，但基质不宜过湿，以防烂苗。
5.请分析植物激素在组织培养中的作用?
(答题要点：(1)、每种植物生长调节剂各自的作用。(2)、相对浓度)
植物激素：是植物自然状态下产生的、对生长发育有显著作用的微量有机物。
植物激素包括：生长素家族、细胞分裂家族、赤霉素、乙烯和生长抑制素。其中前三者是正向激素，后两者为负向激素。
生长素 植物体内的生长素是由色氨酸通过一系列中间产物形成的，主要途径是通过吲哚乙
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0820020044 酸。作用：在植物组织培养中，生长素主要用于诱导愈伤组织形成、诱导根的分化、促进细胞分裂、伸长生长。
Eg：吲哚乙酸：促进生长点细胞的分裂和非生长点细胞的伸长，诱导根原基的发生和根系的生成，促进雌花的分化和果实的成熟。
Eg：萘乙酸为代表的人工合成生长调节剂是一种生长素合成前体。
细胞分裂素 大多是嘌呤族衍生物，细胞生理素的生理作用主要是引起细胞分裂，诱导芽的形成和促进芽的生长。
赤霉素：广泛存在于植物体内，能促进细胞生长，与生长素一起可诱导细胞分化。 经常使用的人工合成分裂素：6-苄氨基嘌呤(BA)、6-呋喃氨基嘌呤(又称激动素，KT) 天然细胞分裂素:玉米素
分裂素和生长素通常一起使用，来促使细胞分裂、生长，一般在培养基中生长素与细胞分裂素的比值高时可诱导外植体生根，比值低时，可诱导外植体出芽，而比值适中时，愈伤组织增殖。
6、植物组织培养中出现的问题：
⑴玻璃化问题，即出现一些半透明状的畸形试管植物，该现象由于能引起植物的组织结构和生理功能异常，因此分化能力低，难以增殖成芽，也难以生根成苗，已成组织培养的一大问题;玻璃化现象主要是适应性的生理问题，其主要的防治措施有;适当提高光照强度，适当降低培养基中NH4﹢浓度，注意通气，注意细胞分裂素和生长素的配合以及激素和K+之间的配合使用，及适当进行低温处理等;⑵褐变问题，也是一种植物组织培养中常见的现象，已成为植物组织培养发展的一大障碍，防止或缓解褐变的方法有：选择适宜的外植体(生长旺盛时期的材料);选择适宜的培养条件(酸性环境);细胞筛选和材料的预处理，主要是剔除是褐变的细胞，减少材料醌类物质的产生等;使用抑制剂和吸附剂;⑶微生物污染问题;⑷其他问题，如研究水平，难培养植物，品种退化问题等。
7.什么是植物胚胎培养?植物胚胎培养有怎样的意义?
植物胚胎培养是指将植物的胚及具胚器官(如子房、胚珠、胚乳)在离体条件下培养，使之发育形成幼苗的过程。其意义有：克服杂种胚的败育，获得稀有杂种;获得单倍体和多倍体;打破种子休眠，促进胚萌发;快速繁殖良种，缩短育种周期;克服种子生活力低下和自然不育性，提高种子发芽率;提高后代抗性，改良品质;用于种子活力快速测定、种质资源的搜集和保存等。
8.植物脱毒的原理、方法：
答案
一、主要有物理、化学和生物三种方法;物理方法有高温处理和低温处理两种方法，高温处理又称热疗法，原理是有些病毒对热不稳定，植物基本不受伤害，得该方法只对部分病毒有效且高温处理容易使植物材料受热枯死，造成损失;低温处理又称冷疗法，原理是降低温度能使病毒活力下降，但该法用时长。化学方法是利用化学药品(嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗生素等)处理患病植物以抑制植物体内病毒的复制，但该法一些化学物质不能使病毒失活，且对植物有毒害;生物方法，其原理是病毒不会侵染植物的每一部位，因此选择不带病毒的外植体来再生植株就可以达到去病毒的目的;有茎尖培养，通常取0.2~0.5mm茎尖，该法周期短、效率高但培养基及剥离技术要求较高;微体嫁接法，适用于茎尖培养脱毒生根困难、不能形成完整植株的植物;另外，还有愈伤组织诱导脱毒、珠心胚培养法和花药培养脱毒。 答案
二、
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0820020044 1物理方法：a.高温处理. 去除病毒的原理是一些病毒对热不稳定，在高于常温的温度下(35-40度)即钝化失火，繁殖力下降，失去侵染能力，而植物基本不受伤害。 包括温汤处理(50度热水中处理数分钟至几小时)
热风处理(35-40度处理几十分钟至数月)
a. 低温处理
原理：降低温度能使病毒代谢能力下降，活力下降。
2.化学方法：原理:利用嘌呤和嘧啶类似物、氨基酸、抗生素等化学药品处理患病植物可以抑制植物体内病毒的复制。 3.生物方法 原理：病毒并不会浸染植物的每一个部位，因此选择不带病毒的外植株来再生植株就可以达到祛病毒的目的。
a. 茎尖培养
最有效的植物脱毒方法，具有周期短、效率高的特点。原理：因为茎尖区无维管束，病毒难以进入。
b. 微体嫁接法 原理：将极小的茎尖嫁接到不带病毒的种子实生苗砧木上得到无毒苗。 c. 愈伤组织诱导脱毒
原理：由无病毒细胞的产生的愈伤组织可以获得无病毒苗。
d. 珠心胚培养法：原理：通过珠心胚培养可以获得无毒的再生植株，同时又保存了母株的遗传特性。
e. 花药培养脱毒
原理：花药培养可产生无病毒植株。
9.脱毒植物的鉴定：
直接检测法(观察症状)
指示植物法，指采用对某种病毒反应敏感、症状明显的植物来检测病毒，指示植物一旦
1摩擦接种(与金刚砂混合)感染病毒就会在叶片或全株上表现出特有的病斑，具体方法有○和○2嫁接法;○3电镜法，用电子显微镜观察样品材料有无病毒存在，并可同时鉴定病毒颗粒大小、形状和结构;○4抗血清检测法，病毒携带抗原，注射进动物体内会在血清中产生抗体得到抗血清，不同病毒产生的抗血清具有高度的特异性和专一性;○5分子检测技术，利用已知病毒的核苷酸序列设计引物，采用PCR技术体外扩增病毒的DNA片段，或者通过探针杂交等分子技术检测。
10.什么是试管动物?试管动物培育一般经过哪几个步骤?其繁殖技术的关键问题有哪些?
试管动物，也称体外受精动物，是指将供体的精子和卵子在体外受精，体外培养胚胎发育到一定阶段，通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。其培育步骤一般经过以下五个步骤：⑴精子采集与体外获能，卵子采集与成熟培养;⑵体外受精;⑶重组胚激活与体外培养;⑷胚胎移植;⑸体内发育、出生。关键问题有：①精子的采集、获能和卵子的采集与成熟培养;②体外受精问题;③胚胎体外培养中的发育阻滞问题;④胚胎移植成活率低的问题;
11.胚胎细胞克隆动物与体细胞克隆动物各有什么优势?
胚胎细胞克隆动物的优势有：⑴受体、供体均是胚胎细胞，胚胎细胞分化程度较低，成功率较高;⑵核供体取自同一胚胎，因而可能一次性繁殖性状相同或高度相似的动物。
体细胞克隆动物的优势有;⑴体细胞数量丰富，易于获得;⑵被获取核供体的动物不受性别限制，年龄不要求在能产生胚胎的年限。
12.胚胎工程动物培育的关键技术环节有哪些?如何控制成功率?
关键技术环节有：体外受精、人工受精、核移植和胚胎移植四个环节;要控制成功率，首先要对各个环节技术熟悉了解及掌握，即深化理论知识;另外在各个环节总结成功的经验，
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0820020044 如在胚胎移植上，应选择与供体发情周期同步的、生殖道正常、无疾病、繁殖史良好的雌性动物为受体接受胚胎移植;最后，还应加强术后护理等，这样将可提高成功率，总之，要控制成功率，应对各个环节的相关技术、应注意的问题进行精细控制，这样才能控制成功率。
13.植物细胞融合的过程：
首先取材(生长旺盛、生命力强的组织)并制备原生质体，即去除细胞壁，去除的方法有机械去除法和生物酶解法，然后纯化原生质体，纯化的方法有离心法(原生质体沉于离心管底部)、漂浮法和离心和漂浮结合法;接着是诱导细胞融合，诱导的方法分为生物法、化学法和物理法;生物法是利用病毒诱导细胞融合(病毒能与宿主细胞膜直接融合，打破两个细胞膜的隔阂引发细胞质的交流)该法需在适当pH下，有足够量的Ca2+存在;化学法是指采用化学诱导剂促使细胞融合的方法，常用的诱导剂有：NaNO
3、高pH的高浓度Ca2+、聚乙二醇(PEG)等;物理法，常采用的方法是电融合诱导法，是利用电场来诱导细胞彼此连接成串，再施加瞬间强脉冲促使质膜发生可逆性电击穿，促进细胞融合的技术。
14.怎样获得植物的单倍体、三倍体和四倍体?
植物四倍体获得的方法：因秋水仙素能特异性地与细胞中的微管蛋白分子结合从而使纺锤丝合成受阻，最终形成染色体加倍的核，故可用秋水仙素来获得四倍体，其具体方法是根据不同植物对秋水仙素的敏感性不同调整秋水仙素浓度，其有效含量一般在0.01%~0.4%，以0.2%左右最为常用，然后，以适宜浓度处理分裂能力强的细胞，处理方法包括浸染法、涂抹法等，浸染法是先将种子浸种催芽，待胚根露白时把种子浸在秋水仙素溶液内24h，浓度高时处理时间可相应短些，且对于幼嫩而分裂迅速的组织也可短些，且处理时温度应在18~25℃之间;另外还可用细胞松弛素B来处理。单倍体的获得方法是：花药和花粉培养，具体方法是先花药制备与培养：取特定时期(单核期)未开放的花蕾，低温处理(放在4℃冰箱预处理)3~5天，然后用70%乙醇擦拭花蕾表面，在无菌条件下剥取花粉，接种于适当的培养基中，于25℃光照条件下培养，然后通过分离、过筛、清洗获得花粉外植体，最后经过植株再生发育成单倍体植株。获得植物三倍体的方法是，用以上获得四倍体的方法得到四倍体后，再以二倍体作父本，与四倍体母本植株杂交便可获得。
15.鱼的三倍体的获得方法：(如何用细胞工程的方法获得动物的三倍体?)
(1)温度休克法获得。温度休克法包括冷休克法(0~5℃)和热休克法(30℃)两种其关键是能否成功地阻止细胞分裂或卵子第二极体的释放。一般来说冷水性鱼类应用热休克法好，温水性鱼类用冷休克法效果较好。(2)水静压法，指采用较高的水静压(如65kg/gm2)可抑制卵子第二极体的释放或细胞分裂，产生多倍体，处理时间较短，一般在3~5min。(3)体细胞杂交，即通过四倍体个体与二倍体个体杂交而获得。
如何利用细胞工程方法获得鱼类或者是贝类的三倍体，四倍体。
生物学:主要通过杂交尤其种间杂交获得异源多倍体
物理学:温度休克法、水静压法和高盐高碱法等
温度休克法原理阻止第二次成熟分裂或第二极体的排出
水静压法原理
抑制第二极体的放出或第一次卵裂产生多倍体
化学:化学物质可用来阻止第二极体的排出或受精卵的有丝分裂而产生3n或4n，如细胞松弛素B。细胞松弛素B原理能抑制肌动蛋白聚合微丝，从而抑制细胞质分裂。
三倍体---原理，四倍体---原理?
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0820020044 如何鉴定得到了三倍体/四倍体?
16.什么是植物细胞培养?其特点有哪些?
植物细胞培养是在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增殖，获得大量细胞群体的一种技术。其特点有：①D10-200um,较微生物大30-100倍，②以一定细胞数的非匀相细胞团形式存在，很少单一细胞悬浮生长;③具纤维素细胞壁和大液泡，很容易被剪切力损伤;④生长速度慢,操作周期长,分批培养需2-3周,半连续/连续培养则2-3个月;⑤培养基成分丰富/复杂，适合微生物生长，防止污染更困难;⑥一般需光照光合, O2 和 CO2的含量与传递对细胞培养影响较大等特点。
17.什么是植物细胞固定化培养，它有什么优点?
植物细胞固定化培养是将游离的细胞包埋在惰性支持物内部或贴附在它的表面多糖或多聚化合物置备成的网状支持物中、培养液呈流动状态进行无菌培养的技术。其方法有：吸附、交联、共价结合和包埋等。其优点有：①细胞包埋后所受剪切力损伤减小，维持了细胞稳定性，适于植物细胞传统生物反应器的大规模培养;②细胞密度较高时不会改变培养液流体性质，利于传质;③次级代谢产物在细胞停长后才大量合成，固定化可将细胞生长与产物合成2个阶段分开;④细胞生长较缓慢，利于次生代谢产物积累;⑤增加细胞之间接触，促进了细胞间信息传递，利于代谢产物合成;⑥固定化细胞可反复使用，可利于连续培养和收获产物，降低成本等优点。
18.什么是次级代谢产物，如何提高植物次级代谢产物?
次级代谢产物上通过次级代谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子化合物，如抗生素、激素、生物碱、毒素等。提高次级代谢产物产量需要考虑的因素有;细胞株、培养工艺、培养技术及培养设备等，具体是选育优良的细胞株，培养时保证培养基和培养条件符合细胞生长和代谢的需要，通过添加次级代谢产物的前体物质进行调控，还可以通过添加表面活性剂增加细胞膜的通透性等。
限制植物细胞培养大规模生产有价值次级代谢产物的影响因素
1.生物因素
(1)细胞株(2)细胞凋亡(3)细胞团(4)生物合成机制 2.化学因素
(1)营养盐(2)前体(3)诱导子(4)反馈抑制 3.物理因素
主要包括：光照、温度、通气、搅拌、pH值等。 (1)光照(2)温度(3)pH 4.工程技术问题
(1)培养液的流变特性、(2)气体传递(3)搅拌与剪切力(4)泡沫与器壁表面粘附性
19.毛状根培养生产次级代谢产物：
毛状根又名发状根，是植株或组织、器官受到发根农杆菌感染后而形成的类似头发一样的根组织。利用毛状根培养可以克服天然根培养存在的难培养等问题与不足。将发根农根杆菌含有的Ri质粒中的T-DNA片段整合到植物细胞的DNA上诱导出毛状根;常用的毛状根诱导的方法有外植体接种法(共同培养2~3d)、茎秆接种法(植株的茎尖、叶片切去，划出伤口，将发根农杆菌接种在伤口处培养)和原生质体—农杆菌共培养法(培养3~5d)。毛状根培养的优点有;生长快，易培养;毛状根分化程度高，产生次级代谢产物能力强;通过
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0820020044 T-DNA改造，易于采用基因工程途径提高次级代谢产物产量等。
20.微藻特点与分类：
微藻分为原核藻类和真核藻类，现国内外已可以大量培养的微藻分别属于蓝藻门、绿藻门、金藻门和红藻门。微藻的特点有：①利用太阳能和CO2通过光合作用生产有机物，生长速度快，效率高，耗能低;②微藻提取有效成分需要复杂的前处理;③种类多，许多微藻可产生有生物活性的化合物;④可能利用贫瘠土地、盐碱地等极端环境;⑤微藻培养简单，容易产业化等。
21.动物细胞体外培养的特点有哪些?需要哪些条件?
培养特点有：①动物细胞大，无细胞壁，对机械搅拌或剪切力敏感;②动物细胞生长缓慢，易受污染;③正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去;④动物细胞间主要以聚集体形式存在，大多需要贴附在载体表面才能生长等。动物细胞体外培养需要的条件有：①培养基，应包括细胞各种代谢所需的各种成分;②需平衡盐溶液、培养基pH调整液、细胞消化液和抗生素液等;③生长条件，包括温度、pH、渗透压、气体等;④培养工具，如GO2培养箱、相差显微镜、培养皿、培养瓶等。
22.动物细胞大规模培养的方法有哪些?各自主要是为了解决什么问题?
动物细胞大规模培养的方法及其为了解决的问题是：⑴转瓶(管)培养系统，为了解决从小量培养到大规模培养的过度问题;⑵微载体培养，为摆脱传统的培养瓶(管)培养限制，实现三维立体贴附培养;⑶中空纤维生物反应器培养，为改善传统培养方法的气体、营养物质及水分等物质的通透性使水分子、营养物质和气体可以透过，细胞也能在上面贴附生长;⑷大规模培养方式，常采用的是流加式培养和灌流式培养的操作方式，该法是为使细胞持续生长到较高的密度，目标产品达到较高水平。
23.动物细胞原代培养及技术要点：
接种组织块直接长出单层细胞或将组织分散成单外细胞再进行培养，在首次传代前的培养称为原代培养。原代培养的优点有：在一定程度上能反映体内的形态学特征，原代细胞是很好的实验材料，原代培养也是建立各种细胞系(株)必经的阶段。
原代培养取材时需要注意的几个问题是：①选择性取材，应选分化程度低、容易培养的组织，如胚胎、新生组织等;②取材要注意使用新鲜材料和保鲜，取材后一般6h内分离细胞;③取材应该严格无菌;④防止细胞机械损伤;⑤避免组织干燥等。 动物细胞原代培养有组织块原代培养和细胞原代培养。
24.与常规细胞工程技术相比，转基因技术在生物遗传改造方面有什么特点?
转基因技术是通过人工方式将外源基因整合到生物体基因组内，并使该转基因生物能稳定地将此基因遗传给后代的技术。其与常规细胞工程技术相比，在生物遗传改造方面的特点有：可实现不同种类生物之间的基因重组，可使人类根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，创造新的生命类型等。
25.乳腺生物反应器：
乳腺生物反应器是将外源基因置于乳腺特异性调节序列之下，使之在乳腺中表达，然后通过回收乳汁获得有重要价值的生物活性蛋白的技术。其在生产药用蛋白上具有巨大的优势，主要表现在：①生产出的药用蛋白与天然蛋白质的活性一致;②动物乳腺不仅能大量持续地表达蛋白质，可维持所表达蛋白质的稳定性，而且可通过诱导系统调控表达;③成本低，
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0820020044 安全性可靠;④药物分离纯化工艺简便等。
26.干细胞有什么特征?如何获得?
特性：具有自我维持与自我更新的能力，具有多方向分化的潜能，即可发育成各种胚胎组织的细胞，或可分化为本系统各谱系的细胞，干细胞分裂能力可维持相当长时间，有的可保存终生，既有生理性的更新能力，也具有对损伤与疾病导致的反应与修复能力。形态特征：通常呈圆形或椭圆形，体积小，核质比例大，具有较高的端粒酶活性，因此具有较强的增殖能力。增殖缓慢，质稳性。
获得的方法：可从早期胚胎内生细胞团或原始生殖细胞也可从自发或诱发的畸胎细胞中分离得到，也可通过核移植方法获得(?)。 伦理方面的问题??
27.目前，胚胎干细胞研究存在的问题：
有：⑴来源限制;⑵体外培养困难;⑶安全性不高;⑷伦理道德问题等。
28.什么叫组织工程，其基本要素有哪些?组织工程有什么作用?
组织工程是利用生命科学、医学、工程学的原理与技术，利用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或再生的一门技术。其基本要素包括：种子细胞、支架材料、细胞因子三个。 其作用主要表现在临床应用上，如用组织工程技术生产一些骨、肌腱、血管，人工肝等器官为医疗提供原料等。
重点建设工程论文范文第6篇
1, 细胞工程：是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的实验方法或技术，在细胞水
平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术。狭义的细胞工程是指细胞融合和细胞培养技术。
根据研究对象的不同，高等生物的细胞工程分为动物细胞工程和植物细胞工程。动物细胞工程包括细胞培养技术(包括组织培养、器官培养)，细胞融合技术，胚胎工程技术(核移植、胚胎分割等)，克隆技术(单细胞系克隆、器官克隆和个体克隆)。植物细胞工程包括植物组织、器官培养技术，细胞培养技术，原生质体融合与培养技术，亚细胞水平的操作技术等。
2, 植物细胞工程：以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操 作，使细胞得某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程称… 植物细胞工程的应用：
1， 利用细胞融合技术，克服远缘杂交不亲和性。 2， 利用培养变异，筛选优良的突变体。 3， 倍性育种，缩短育种年限。
4, 离体种质保存。 5,
细胞培养生产有用的物质。 第二章
一， 实验室设置及内部设备
实验室建设应考虑的问题：
1、实验的性质
2、实验室的规模
细胞工程实验室: 基本实验室:准备室、无菌操作室、培养室 贮藏室 辅助实验室：细胞学实验室、生化分析实验室 温室
1、准备室
完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、 配制、培养基分装及高压灭菌;器皿、材料的洗涤等工作。
主要设备
纯水器 工作台 药品厨 天平 电磁炉 冰箱 玻璃器皿 酸度计 高压灭菌锅 干燥箱等
2、无菌操作室 (接种室)
用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。
接种室应用推拉门，设有缓冲间，面积2m2为宜。进入接种室前更衣换鞋，减少带入接种室杂菌。
接种室主要设备
超净工作台 ：每次实验前要用紫外灯灭菌20min，关掉紫外灯开始工作，工作过程中注意一直开着吹风机。
无菌操作用具： 离心机 细胞融合仪
3、培养室
用于接种材料的培养。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。 控制：温度、光照、湿度。
培养室主要设备：培养架 空调 时控器 自动开灯、关灯温度自动记录仪 摇床 二 ，培养基
1，培养基的种类
1 培养基根据其态相不同分为固体培养基与液体培养基。根据培养物的培养过程，培养基分为初代培养基和继代培养基。根据作用不同，培养基为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。 根据营养水平不同，培养基分为许多种,常用如下： (1) MS培养基：富盐平衡培养基(还有LS、BL、ER)
特点: ①无机盐浓度较高，元素比例合适，是较稳定的平衡溶液;②微量元素种类齐全; ③营养丰富 。
(2)B5培养基 ：高硝态氮培养基(还有N6和SH培养基)
特点: ①硝酸钾含量高; ②氨态氮含量低; ③ VB1含量较高。 (3)N6培养基：高硝态氮培养基
特点：硝态氮含量高，氨态氮含量较低。
(4)White培养基：低盐培养基(还有WS、HE、改良Nitsch等 特点：无机盐含量低，有机成分也很低，适于生根培养。 (5)KM-8P培养基：
特点:有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。 培养基成分：水 无机盐 有机成分 植物激素 培养物支持材料 辅助性物质 2，植物激素的应用规律
①先Aux后CKs处理,有利于细胞分裂但不利于细胞分化。容易产生多倍体细胞(核分裂和胞壁形成不同步所至)， cks有利于胞壁形成。
②先CKs 后Aux处理，细胞分裂也分化(可能是内源生长素起作用) ③ Aux 和CKs 同时处理，分化率提高。 Aux与CKs的比值改变形态建成的方向。
高 有利根分化，抑制芽形成; Aux / CKs 适中 促进愈伤组织生长;
低 有利芽分化，抑制根形成;
在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异, 培养基配制：
1、确定配方
2、移母液
3、定容
4、称蔗糖
5、调PH值(用0.1MNaOH或HCl调PH值为5.8)
6、培养基熬制(加琼脂)
7、分装(100ml的三角瓶约装入30-40ml, 30瓶/L)
8、扎口
9、灭菌
10、接种 三，植物材料灭菌
灭菌方法 ①.培养基灭菌：高压湿热灭菌，某些激素采用过滤灭菌
②.玻璃器皿灭菌：干热灭菌：150℃ 40min;120℃ 2h，湿热灭菌：121℃, 30min 接种前用酒精棉球擦试，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。
③.接种工具灭菌：用前干热灭菌，用前湿热灭菌，接种前用酒精棉球擦试，浸入95%酒精液中，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。 电热石英砂灭菌器 ④.实验服、口罩灭菌：湿热灭菌
⑤.接种室灭菌 ：紫外灯照射(接种室、超净台)：波长260nm，距离小于1.2m，15-20min。臭氧灭菌机：1-2h,熏蒸灭菌：(5-8ml甲醛+5g高锰酸钾)/ m3 ,接种台喷雾消毒：75%酒精。 ⑥.培养室灭菌 : 新建培养室用前要彻底熏蒸1次。
隔1周用洗衣粉水或来苏水拖地1次，用高锰酸钾擦架1次。
⑦.物体表面灭菌: 灭菌方式：喷雾、涂抹杀菌 ,范围：超净台的台面和四壁、双手 消毒剂：70%酒精;1-2%来苏水;1%新洁尔灭等。
⑧.接种材料消毒: A, 取材 营养器官：根、茎尖、茎段、叶片等
生殖器官：胚胎(胚、胚珠、胚乳等)和花药 等
外植体〔explant〕：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料 外植体灭菌
用化学灭菌剂灭菌
2 消毒步骤：①流水冲洗或洗衣粉漂洗②用化学灭菌剂浸润消毒通常：70%酒精30S，0.1%升汞4-10min。表面有较厚蜡质层的的可加吐温-20或吐温-80等浸润剂(灭菌液的0.5%)。 ③无菌水冲洗3-5次。注：灭菌液要浸没材料 第三章 植物细胞全能性与形态发生
一、植物细胞全能性(totipotency)：植物体每个正常细胞都含有该植物的全部遗传信息，在适宜的条件下如同受精卵一样, 具有发育成完整植株的潜在能力。
细胞分化〔cell differentiation〕指由于细胞分工而导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。 细胞脱分化〔cell dedifferentiation〕培养条件下使一个已分化的细胞失去已分化细胞的典型特征，或消除了细胞分工，使之回复到分生细胞状态或胚性细胞状态的过程。或具有特异结构和功能的细胞转化成没有特异结构和功能的细胞的过程。
愈伤组织〔callus〕植物离体培养过程中脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生的无组织结构、无明显极性、松散的细胞团称为愈伤组织。多在外植体切面上产生。
愈伤组织的特征：细胞分裂快，结构疏散，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。成功地脱分化将导致细胞分裂，形成愈伤组织或胚性细胞团。
植物胚胎干细胞：植物连续的器官分化是由顶端分生组织细胞发育而成，因此，植物顶端分生组织细胞具有较强的表达全能性的能力，被称为植物胚胎干细胞。
生理脱离效应;当细胞或组织脱离母体以后，在适宜的条件下将进行一些特殊的发育方式，如再生、复壮等，child将其称为生理脱离效应
(细胞)或(组织)与母体分离和激素的调控是细胞全能性表达的前提。 在离体培养条件下，细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的。脱分化是细胞全能性的表达前提，再分化是细胞全能性的表达最终体现。
静止细胞(G0细胞)启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。
细胞脱分化的三个阶段 ：1，启动阶段 细胞质增生并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白出现。 2，演变阶段 细胞核向中央移动，质体转变为原质体 3，脱分化终结期，回复到分生组织。
细胞再分化〔redifferentiatio〕脱分化后无序生长的分生细胞在离体培养下，重新恢复细胞分化能力，经过细胞分化、组织分化和器官分化递进地进行，最后再生完整植株。
极性(polarity)：植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志(即细胞分化的标志)。 激素在植物生长发育中具有重要的调控作用，也是离体培养条件下，调控细胞脱分化和再分化的主要因素。其中生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分化的植物激素。
在离体培养条件下TEs则由愈伤组织薄壁细胞分化形成这是愈伤组织细胞分化器官的前提。 植物的离体器官发生：培养条件下的组织或细胞团(愈伤组织)分化形成不定根、不定芽等器官的过程。
离体培养中器官发生的方式
通过器官发生形成再生植株大体上有3种方式：
①先芽后根:是应该选择的方式.②先根后芽 ③根芽同长 植物细胞经再分化形成植株有2条途径：(在离体培养条件下)器官发生 体细胞胚胎发生 体细胞胚(胚状体、体胚)：指离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物。
胚状体有以下几方面的界定：
①体细胞胚是离体培养的产物，只限于在离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚;②体 3 细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚;③体细胞胚经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官发生形成个体的途径。
经过愈伤组织的胚胎发生需要3个培养阶段： ①诱导外植体形成愈伤组织;②诱导愈伤组织胚性化 ，③体细胞胚形成。 体细胞胚的结构与发育特点
1、与器官发生途径相比，体细胞胚在组织学上有3个特征： ①体细胞胚最根本的特征是具有双极性，即在发育的早期阶段从方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都是单极性的;
②体细胞胚的维管组织与外植体现存组织无解剖结构上的联系，而不定根或不定芽与外植体或愈伤组织的维管组织有联系。
③体细胞胚胎的维管组织分布是独立的Y字形结构，不定芽维管组织无此结构。 人工种子：(狭义)植物离体培养中产生的体细胞胚，包裹在含有养分和具有保护功能的物质中，并在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。
(广义)在体细胞胚、微型营养变态器官、不定芽等微繁体之外加上必要的营养成分后，用具有一定通透性而无毒的材料将其包裹起来，形成的与天然种子相似的颗粒体。 第四章 离体培养下的遗传与变异
离体培养中的遗传与变异特点：
1、普遍性：变异可发生在各种培养类型中; 变异发生在各种植物的培养中;变异发生与培养类型有关。
2、局限性：一些单基因控制的性状不仅发生隐形突变，也发生显性突变。
3、嵌合性：是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞它是组织培养中常见的现象。 体细胞变异诱导材料的选择：其一，目标性状的可行性。体细胞突变的频率虽然较高，但对于某一个体来讲，变异的性状是个别的，因此选择综合性状良好的植物品种材料，通过诱变改变个别不良性状，是体细胞突变系选择的目的。其二，必需充分考虑试验植物的细胞培养技术水平，只有对起始材料有良好的培养技术，才有可能制定完满的诱变及选择方案。如果起始细胞的培养技术不成熟，不能再生整株，则不能进行后续的各项操作。 其三，适当的细胞类型亦是提高体细胞突变系筛选效率的重要条件。 第五章植物主要的组织培养技术 第一节快繁
无性繁殖途径：
1、无融合生殖：即不经过减数分裂和受精而形成种子。
2、营养繁殖：即由母株的营养体部分再生出新的植株 植物离体快速无性繁殖：利用离体培养技术,用优良植株的外植体进行培养,在短期内获得大量遗传一致的个体的方法，这种离体无性繁殖方法由于繁殖速度快，又称离体快速无性繁殖。所获得的株群称单株无性系或单芽无性系
初代培养 ：芽、茎段、叶片等外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体过程。即接种某种外植体后，最初的几代培养。
生根培养：将芽苗转接到生根培养基上培养成为完整植株的过程 植物快繁常见问题及对策：
(一)污染的原因及预防：原因：细菌、真菌为病源菌;污染途径有外植体带菌，培养基及器皿灭菌不彻底，操作人员未遵守操作规程，环境不清洁。 预防措施：(1)防止材料带菌：避免阴雨天在室外采集外植体;春秋组培;材料预培养。(2)严格外植体灭菌(3)接种用具灭菌彻底(4)严守无菌操作规程(5)保持培养室清洁
(二)褐变的原因及预防原因(1)植物品种(基因型)(2)生理状态(3)培养条件(4)材料转接季节 防止措施(1)选择适宜的外植体(2)连续转接3)先液体培养再固体培养(4)加抗氧化剂(5)选择合适的培养条件加活性炭或 暗处培养。
(三)玻璃化的原因及预防原因：
(1)激素浓度(尤其CTK)高(2)琼脂浓度低(3)光照弱(4)温度高(5)通风条件不好(6)培养基离子种类及比例不适宜 预防措施：(1)适当控制培养基中无机盐成分，适当提高蔗糖和琼脂浓度，减少含氮化合物的用量，降低培养基的水势。(2)适当降低CTK的浓度。考虑加入适当的脱落酸。(3)增加自然光照;增加容器通气，控制温度。(4)加入活性炭、多效唑或CCC等物质。 第二节、植物脱毒快繁技术 1热处理脱毒原理：
①病毒是DNA大分子，病毒进入植物细胞后，随植物细胞DNA一起复制。热处理并不能杀死细胞，只是钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去病毒的侵染能力。
②热处理是一种物理效应，可加速植物细胞分裂，在激烈分裂的细胞中正常核蛋白合成占优势，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。因此加速分生组织细胞的分裂，能够获得无病毒植株。
2、热处理脱毒方法：(1)温汤浸渍处理 适用于休眠器官，在50℃左右的温水中浸渍10min至数小时，方法简便易行，但易使材料受伤。(2)热空气处理 热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好。将生长的盆栽植株移入温热治疗箱内(35-40℃)处理时间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。
分生组织不带病毒，可能有4方面的原因：
1、植物体病毒的移动主要靠2条途径：一是通过维管系统，而分生组织中尚未形成维管系统;二是通过胞间连丝，但这条途径病毒移动速度非常慢，赶不上茎尖和根尖细胞不断分裂和活跃的生长速度。
2、当植物细胞分裂DNA复制时，病毒DNA随着复制。因此，植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在相互竞争。在旺盛分裂的分生组织中，代谢活动很高，正常核蛋白合成占优势，使病毒无法进行复制。
3、茎尖中存在高水平内源激素，可抑制病毒的增殖。
4、在植物体内存在有一种“病毒钝化系统”，在分生组织中的活性最高，因而使分生组织不受侵染。
第三节 花药和花粉的培养
花药培养:将花粉发育至一定阶段的花药培养在人工培养基上，诱导其花粉粒改变发育进程，形成花粉胚或愈伤组织，进而分化成苗的过程。(器官培养) 花粉培养(小孢子培养)：将发育至一定阶段花粉从花药中分离出来成为分散或游离状态，花粉脱分化后再生成苗。(细胞培养)
单倍体：具有配子体染色体数的孢子体。
单倍体植物3个明显特点：
1、体细胞染色体数减半
2、生长发育弱，体形小
3、雌雄配子严重不育
花药、花粉培养的意义
1、迅速获得纯合型材料，提高选择效率，缩短育种年限
2、获得育种中间材料
3、突变体选育
4、体细胞融合
5、遗传研究
6、获得染色体异附加系和代换系
7、遗传工程受体 花粉植株再生途径：
1、经由成愈伤组织再生植株
2、经由胚状体再生植株 花粉分离收集：
由于花粉包于花药内，必须将它们从花药中分离、收集才能进行培养。方法： 1)花粉漂浮自然释放法:将花药接种于液体培养中，使花粉自然释放。 2)人工挤压法:用玻璃棒捣碎花药使花粉释放。
5 3)机械法:用磁力搅拌器打碎花药释放花粉。
释放的花粉粒→ 尼龙网(孔径20—60um)过滤，除去药壁等组织 → 500-1000转/分离心1-5分钟，收集花粉。
花药培养过程中花药为什么要经过低温处理 低温处理的作用机理：
1)预处理引起花药、花粉内源激素发生变化，改变了小孢子(花粉粒)第一次有丝分裂的轴向发育(正常发育时，两次有丝分裂形成三核花粉粒)，进而形成愈伤组织或胚状体。 2)提高小孢子的生活力，延缓退化速度，而提高了诱导率。
3)引起小孢子孤立化，即小孢子从花药中分离。因为低温处理过程中，花药内薄壁细胞和绒毡层逐渐退化，从而切断与小孢子之间的联系。 花药培养时为什么要用较高浓度蔗糖和较低浓度激素?
蔗糖浓度 培养基中蔗糖浓度比其它组织培养高，尤其早期培养，一般5%—10%原因是花粉母细胞的渗透压比花丝等体细胞高，即高浓度的蔗糖不利于药壁、花丝等体细胞的生长，而利于花粉的生长。
激素 花药壁分化程度高，重新分裂需要较高的激素浓度才能启动。因此，花药培养基的激素水平要相对较低才能抑制二倍体细胞的分裂。确定适宜的激素浓度，以促使花粉细胞分裂的同时又抑制花药二倍体细胞分裂是成功获得单倍体的关键。 第四节 胚胎培养
胚胎培养类型 胚培养 胚乳培养 子房培养 胚珠培养
胚培养概念：无菌条件下，把胚从种子、子房或胚珠中分离出来，在培养基上进一步生长发育形成幼苗的过程。
成熟胚培养：是指子叶已形成的种胚。仅提供一定的温度、湿度就可以发芽生成植物体。如种子的发育
成熟胚培养意义：克服发芽障碍;打破种子休眠，缩短育种周期等。 幼胚培养：胚龄处于原胚期、球形胚、心形期、早鱼雷期的培养。
幼胚培养意义：
1、克服远缘杂交不育
2、克服珠心胚干扰，提高育种效率
3、幼胚具有较高再生能力，可通过体细胞胚胎发生产生大量的再生植株。
4、为原生质体培养、细胞融合及基因转化提供试验材料。 幼胚培养时胚的发育方式有哪几种?各有何特点?
① 胚性发育：幼胚的离体培养，仍按在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株
② 早熟萌发：离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称为早熟萌发。在大多数情况下，一个幼胚萌发成一个植株，但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞，以后形成许多胚状体，从而可以形成许多植株，这种现象就是所谓的丛生胚现象。
③愈伤组织：在许多情况下，幼胚的离体培养首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。 胚乳按发育初期是否形成细胞壁分为①核型胚乳②细胞型胚乳③沼生目型胚乳 试管受精：培养未受精的胚珠或子房并在试管内撒播花粉，使其受精形成具有生活力的种子。 未授粉胚珠子房培养与授粉后胚珠子房培养有何不同?
根据培养的胚珠是否受精将胚珠培养分为受精胚珠的培养和未受精的胚珠的培养。(1)未受精的胚珠的培养,目的是为试管受精提供雌配子体。(2)受精后胚珠的培养,胚珠内胚的发育处于早期阶段,从两个细胞的原胚开始至球形胚阶段。
6 第六章 植物细胞培养及次生产物代谢生产
植物细胞培养：是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其 增殖的技术. 培养方法：培养规模:小规模培养 大批量培养
培养方式:悬浮培养 平板培养 看护培养 产物不同:诱变培养 次生产物培养
培养方式：悬浮培养、单细胞培养、植物细胞的规模化培养及有用物质生产
悬浮培养(cell suspension culture)悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。
成功的悬浮细胞培养体系必须满足3个条件：
1、浮悬培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。
2、均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。
3、细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加1倍。
培养周期的概念 具有一定起始培养密度的单细胞，从开始培养到细胞数目和总重量增长停止这一过程，称为一个培养周期。
悬浮细胞培养的同步化：指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。(植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。)
细胞同步化的方法：①分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。
②饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。
③抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期的同步化细胞。 ④低温法：冷处理也可提高培养体系中细胞同步化程度。
单细胞培养
1、平板培养
2、看护培养
3、微室培养
4、双层滤纸培养 植物次生代谢产物：植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。
植物细胞大规模培养的技术要求：从细胞生长与培养技术方面讲必须满足以下3个条件
1、培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物。
2、细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物。
3、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。 固定化培养系统--固定化培养技术的优点在于：
1、可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节;
2、细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成;
3、由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用;
4、正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。
7 利用细胞培养生产有用物质的一般程序
1、选材 应注意条件：①药效肯定②对其有效成分有充分的了解④市场短缺或价格昂贵;③有测定有效成分和药理的可靠方法⑤取有药效成分的部位，且该部位较易形成愈伤组织。
2、细胞株系建立
3、大量培养
4、产品提取与纯化 第七章 原生质体培养与融合 原生质体(Protoplast)：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。
亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。
核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。
胞质体(cytoplast)：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。
原生质体材料预处理 (暗处理，预培养和低温处理)原因：预质壁分离可使胞壁内表层充分暴露，增加胞壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降解速度;降低原生质体内电解质渗漏，防止在分离期间外来酶被吸入细胞内，降低原生质体对酶液中可能存在的有害影响的敏感，提高原生质体的稳定性和存活率。 原生质体纯化方法有：
离心沉淀法 原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。 漂浮法 原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。
接口法 原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密度，原生质体介于两种溶液之间。 原生质体培养方法
1、固体包埋培养(原生质体纯化后，离心，用培养基稀释至一定密度，再与0.6%琼脂或低溶点琼脂糖(37C左右)混合，培养于培养皿中。)
2、固体平板培养
优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率。 缺点: 操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀。
3、液体浅层培养(将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。) 优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。
4、固、液培养 优点：固体培养基中的营养物质可缓慢释放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。
缺点：不易观察细胞的发育过程。
5、共培养法(将生长迅速的原生质体培养物与难于培养的原生质体混合)
6、琼脂糖珠培养
7、饲养层培养
原生质体再生：再生细胞壁、细胞分裂和生长、植株再生(愈伤组织形成)
原生质体融合又称体细胞杂交是指将植物不同种、属甚至科间的原生质体通过人工诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。 融合方法
1、NaNO3法 NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合 8 在一起 不足：诱导频率不高。
2、高pH-高Ca离子法 优点：杂种产量高。不足：高pH值对细胞有毒害作用
3、PEG法 特点：融合频率高、可重复性强、诱发融合无特异性、毒性较低
4、电融合法 特点 不存在对细胞毒害的问题、融合效率高、融合技术操作简便 原生质体的融合过程包括3个主要阶段：1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近; 2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合;3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。 供体-受体式细胞融合包括非对称杂交和细胞质杂交两种方式。
非对称杂交是一亲本的细胞核和细胞质与另一亲本的少量核物质(1～2条染色体)和全部细胞质融合;
细胞质杂交是一亲本的细胞核和细胞质及另一亲本的全部细胞质融合，可能使两种来源不同的核外遗传成分(细胞器)与一个特定的核基因组结合在一起，这种杂种叫细胞质杂种。 第九章后
1, 超低温通常是指-80℃以下的低温。常用的保存介质或容器有：超低温冰箱(-80～-150℃)、液氮(-196℃)和液氮蒸汽箱(-140℃液氮)等。
2, 用于离体超低温保存的植物材料一般有愈伤组织、悬浮细胞、胚、花粉和茎尖等。 3, 细胞内外水的冻结状态时细胞冻存技术的关键。
4, 种质超低温保存的关键是降温冰冻过程中避免细胞内结冰。在降温过程中必须使细胞发生适当程度的保护性脱水，使细胞内外的水流到细胞外结冰，并且在化冻过程中防止细胞内次生结冰。因此针对不同种类的植物材料，筛选合适的冰冻保护剂，采用适当的降温冰冻速度和化冻方式可能使细胞不受损伤或使损伤减小到最低程度。
5, 超低温保存植物种质资源的程序包括培养材料的准备、预处理、冰冻及保存、化冻处理、细胞活力和变异的评价及植株再生等几个步骤。
6, 降温方法从降温方式来看，有快速冰冻法、慢速冰冻法、两步冰冻法和逐级冰冻法等。 7, 玻璃化：是指液体转变为非晶体的固化过程。使溶液玻璃化得两条途径：大幅度提高冷却速率和增加溶液的浓度。
8, 玻璃化溶液(PVS1),其中包含了20.5%的DMSO、15.5%的乙酰胺、10%的1,2-丙二醇以及6%的聚乙二醇，他们分别起到冰冻保护、毒性中和、强化玻璃化和非渗透聚合的作用。 9, 超低温保存方法主要有：玻璃化法、包埋玻璃化法、干燥法、预培养法、预培养-干燥法和包埋脱水法。
10, 包埋脱水法的三个步骤：先将材料用藻酸钙包埋，然后将包埋后含有保存材料的藻酸钙小珠在含有高浓度(或梯度浓度)蔗糖的培养基上预培养，最后侵入液氮。
11, 玻璃化法是将生物材料经极高浓度的玻璃化溶液快速脱水后直接投入液氮，使生物材料连同玻璃化溶液发生玻璃化转变，进入玻璃态。