猪瘟 (Swine Fever) 又名猪霍乱 (Hog Cholera , HC) , 它是由猪瘟病毒 (Classical Swine Fever Virus, CSFV) 引起的一种急性﹑高度接触性传染病, 欧洲人称之为古典猪瘟。家猪和野猪均是CSFV的自然宿主。本病根据其临床症状, 可划分为典型性猪瘟和非典型性猪瘟。目前, 由于CSFV毒力强弱不一, 免疫程序不合理, 疫苗剂量不够等因素致使典型性猪瘟趋少, 而非典型性猪瘟逐渐增多。寻求有效的猪瘟控制措施成了当前兽医工作者的当务之急。由于非典型性猪瘟的临床症状及其病理变化不及典型性猪瘟病例明显, 导致临床诊断越来越困难。目前, 本病的诊断主要以实验室诊断为主。
标准的实验室诊断程序是防控非典型性猪瘟的重要手段之一, 实验室诊断方法主要包括病毒及病毒抗原的检测和血清学检测两个方面。此诊断报告在实验室诊断中采用了猪瘟直接免疫荧光抗体试验和夹心ELISA的方法。
1 发病情况
2007年9月, 兰州市郊某中型猪场发生以主要感染1月龄以内仔猪的病例, 并在猪群中迅速传播。仔猪感染率为37.5%, 病死率达100%。发病仔猪达5~7头/窝, 多数发病仔猪呈急性经过 (一周之内) , 最终死亡。使用抗生素等药物或其它治疗方法, 均不见效果。
2 流行病学调查
该猪场主要以圈养式为主, 采取自繁自养的养殖方式。猪场圈舍设计、布局及卫生条件符合国家规定标准。场内每周消毒一次, 保温较好, 但通风条件较差。猪场每年在春秋来临之季分别对猪群进行猪瘟、猪肺疫、口蹄疫等疫苗程序免疫。在发现此病后, 工作人员对猪场病猪、疑似感染猪进行隔离, 且每天进行严格消毒, 对未感染仔猪和母猪进行紧急疫苗接种 (猪瘟﹑猪肺疫﹑口蹄疫和猪呼吸与繁殖障碍疫苗) 和抗生素治疗。
3 临床症状
本次发病仔猪病程大致可划分为三期:早期表现为食欲略有下降, 身体消瘦、被毛粗乱, 精神萎顿;中期以上症状有所恢复, 发病仔猪腹下、鼻端、耳根和四肢内侧等部位出现针尖大小的出血点, 体温略有升高。两眼或单眼有结膜炎, 有多量黏液—脓性分泌物, 严重时眼睑完全被封。食欲正常, 没有便秘或腹泻等症状;病程后期 (3~5 d后) 原先出现红疹区的部位大面积起皮, 鼻端有溃烂现象, 四肢皮肤发绀, 耳朵、尾巴发生干性坏疽, 体温先是略有升高, 而后正常;表现为精神不振, 呆滞, 食欲减少, 进而停食, 突然死亡。母猪不表现明显的临床症状。
4 剖检变化
病死仔猪尸体剖检可见下颌淋巴结、腮下淋巴结、支气管淋巴结和肠系膜淋巴结周边都有肉眼几乎不可见的针尖大小出血点, 切面呈大理石样。扁桃体肿胀;肺脏、脾脏、胰脏、心房有不同程度的出血点;肾脏苍白, 也有针头大小出血点;胆汁为黄色, 呈糊状;小肠及其浆膜上有充血、出血;小肠内容物比正常略有干燥。仔猪肋骨肋软骨交界出现一条白线, 附近有出血带。
5 实验室诊断
5.1 猪瘟直接免疫荧光抗体试验
剖检病死仔猪, 取其扁桃体、肾脏、淋巴结等组织。速冻1 min后, 进行冰冻切片, 厚度为6 μm, 切片展贴于洁净载玻片上;经丙酮固定15 min后, 用PBS缓冲液漂洗, 自然风干;用猪瘟、猪细小病毒、猪病毒性腹泻的三价荧光抗体 (购自中国兽药检察所) 滴加于切片表面, 于37℃下作用0.5 h后, 轻漂洗, 自然干燥;封固盖片, 镜检。于荧光显微镜视野中, 可见组织上皮细胞浆内呈现黄色、绿色或黄绿色, 细胞核不着色, 细胞轮廓分明, 为猪瘟病毒感染阳性。
5.2 夹心ELISA
5.2.1 材料与方法:
猪瘟抗原诊断试剂盒 (购于美国IDEXX公司) ;已包被96孔微量滴定板;Sunrise酶标仪;Varian Cary50紫外分光光度计;超速离心机等;随机抽取5头患病仔猪的肝、脾、肾、淋巴结和血液;夹心ELISA诊断方法操作步骤见试剂盒说明书。
5.2.2 原理﹑计算及判定依据:
能与猪瘟病毒结合的多克隆血清 (包被反应板) 加待检样品, 充分结合后按先后顺序分别加猪瘟病毒特异性单抗、酶标抗体和底物, 最后观察颜色变化。在单一波长450 nm或双波长450 nm和620 nm处用Sunrise酶标仪测定各反应孔的OD值并计算结果。
计算:Corrected OD = Sample OD- Neg.control OD。
判定依据:为了确保试验的有效性, 阳性对照的平均OD值要大于0.500, 阴性对照的平均OD值要低于阳性对照的平均OD值的20%。
样品的修正吸光光度值大于0.300, 则为阳性;样品的修正吸光光度值小于0.200, 则为阴性;样品的修正吸光光度值介于0.200和0.300之间, 判定为可疑。
5.2.3 夹心ELISA诊断结果:
根据夹心ELISA的操作步骤, 得出OD值, 见表1。
实验有效性判定。阳性对照OD值0.803 > 0.5;阴性对照OD值0.091 < 0.803×20﹪ = 0.160 6。
故该试验有效。
判定样品修正值见表2。
由以上结果得出所检测病猪的肝脏、脾脏、肾脏、淋巴结、血液样品均为阳性, 即其肝脏、脾脏、肾脏、淋巴结、血液中猪瘟抗原阳性。
故实验室确诊此次病患流行为由CSFV引起的非典型性猪瘟。
6 讨论
CSF是猪的一种高度接触性传染病, 该传染病可分为急性、亚急性、慢性、非典型性和不明显型。从20世纪80年代以后, 临床症状不典型且病程变长的非典型性猪瘟成为该病的主要发生形式, 持续感染普遍存在, 疫苗的预防效果明显下降, 给本病的防制造成了很大的困难和障碍。一般认为是猪感染了CSFV变异毒株后发生非典型性猪瘟, 这种变异毒株是在免疫压力下出现的毒力变异毒株。
6.1 病因
猪瘟病毒只有毒力强弱之分。当CSFV低毒株感染妊娠母猪时, 起初常不被发觉, 但病毒可侵袭子宫中的胎儿, 分娩时排出大量CSFV。在此次病例中, 虽没有产死胎和弱仔的现象。但据报道这种先天性感染的仔猪虽出生时正常, 保持健康, 几个月后会发病, 并且在此期间可作为病毒散布的持续感染来源而很难被辨认出来。
由于CSFV的某些毒株毒力性状不稳定, 通过猪体一代或多代后可使毒力增强, 所以很有可能使仔猪发病提前, 从而使发病期提前在一个月内。
针对本次病情, 调查得知, 该场场主所选用的猪瘟兔化弱毒疫苗购自于当地兽医防疫站。该苗虽然具有高度安全性和优良的免疫原性, 但由于以往评价疫苗免疫效果及制定免疫标准通常是以防止临床感染为标准。应用这一标准时, 常有部分猪免疫后, 抗体水平不能防止亚临床感染。尤其是亚临床感染的妊娠母猪, 虽无明显症状, 但却是CSFV的主要宿主, 不仅可以通过垂直传播传给仔猪, 并且可以通过公种猪对其它母猪进行水平传播, 从而将该病蔓延至整个猪场。
另外, 笔者认为, 养殖场户的免疫程序不合理导致了疫苗免疫合格率不高。 场主于仔猪20日龄以后才开始接种猪瘟疫苗, 而母猪乳中的母源抗体在产后15 d已开始下降, 期间出现一个猪瘟免疫空白期, 这对一个被CSFV污染的猪场是很危险的。
仔猪出生后注射了一系列的保健针、防疫针 (猪瘟﹑猪肺疫﹑口蹄疫和猪呼吸与繁殖障碍疫苗) , 从而使得仔猪应激太频繁, 很可能减弱仔猪产生抗体的机能, 降低预防接种的效果。
据场主介绍, 由于当时注射疫苗针头不足, 某些猪共同使用一个针头。该操作很容易将CSFV带入其它健康猪体内, 造成此病的快速蔓延。
在发生此病后, 场主采用了紧急接种和抗生素治疗相结合的策略。然而, 一般情况下, 使用弱毒疫苗前后一段时间, 不应使用抗菌药物。研究证明, 链霉素、新霉素、卡那霉素、四环素、糖皮质激素等药物或对动物体内抗体的形成有抑制作用, 或对T、B 淋巴细胞的转化有明显抑制作用, 从而影响免疫效果。因此, 在免疫前后, 不可使用抗生素药物。
发病猪场位于市郊, 但场舍的通风设施不佳。其次, 饲料营养的合理调配也至关重要。该养猪场的饲料是从外地买回原料后自行配制, 饲草较单一, 应注意调剂的使用, 多加入青绿多汁饲料和骨粉等, 增加胡萝卜素和钙磷物质的含量, 以满足猪只的营养需要。
6.2 实验室诊断
猪瘟荧光抗体染色技术检测细胞内的病毒。它具有检测时间短、操作简便、结果直观、准确率高等特点。目前, 许多国家和地区已将该法作为执行消灭猪瘟规划的法定诊断方法, 也是我国实验室诊断猪瘟病毒最常用的方法之一。它主要用于检测病毒抗原, 也可检测抗体。该技术的关键是制备高效价的高免疫血清, 从中提取IgG, 进行免疫荧光标记。
夹心ELISA具有灵敏性高、特异性强的优点, 目前已成为我国诊断CSFV最常用的诊断方法。然而由于该操作时间较长 (2 d) , 有时可能会延误猪场对该病的防治。目前, IDEXX公司生产的Herdchek猪瘟抗体ELISA试剂盒有快速和过夜两种模式, 快速模式3 h内出结果, 充分弥补了中和试验的不足之处。
6.3 防治措施
防治本病需坚持“预防为主”的主导思想。加强饲养管理, 健全防疫卫生制度, 严格执行卫生预防措施, 定期消毒, 严防病原传入;购买质量可靠的疫苗, 防止疫苗失效;防疫注射做到头头免疫。针对此次病例的特点, 笔者提几点综合防止措施。
净化猪场, 开展猪瘟的抗体检测, 及时检出低抗体的病猪, 淘汰隐性感染的母猪。通过免疫检测, 还能为制订合理的免疫程序提供可靠的依据。目前检测猪瘟抗体的方法很多, 常用的有ELISA 法和间接血凝法等。保证空怀母猪母源抗体不低于1∶64, 分娩母猪不低于1∶32。
规范免疫接种操作规程, 建立合理的免疫程序, 制定免疫程序的关键是如何排除母源抗体干扰, 确定合适的首免日龄。一般认为母源抗体效价降到1∶4~8 时是猪瘟疫苗首免的最佳时期。同时加大剂量亦可中和一定的母源抗体。可供参考的免疫剂量为:种猪4~5 头份;仔猪2~3 头份;仔猪母源抗体在1∶32 以上时, 以4头份疫苗剂量的免疫效果最佳。
其次, 猪场应根据具体情况建立自己的免疫程序。一般根据抗体的水平进行免疫注射。不能测抗体则可参考以下免疫方法:仔猪在20~25 日龄用猪瘟活苗进行首免, 每头仔猪接种2头份;60~70日龄用猪瘟活苗进行二免, 每头接种3~4头份;种猪在200~220日龄用猪瘟活苗进行三免, 接种4~6头份。种用成年公猪每年补防2次, 每次接种4~6头份。经产母猪在断奶时或配种前补防1次。
发现可疑疫情, 立即采集病料, 送至有关单位作抗体和抗原的检测。测定抗体水平是为本场建立合理的免疫程序提供科学的依据, 而测定抗原才可以发现病原, 确诊疾病。一旦确诊存在非典型猪瘟, 应立即对易感猪进行检疫, 并分为三种类型:一是体温高达41℃以上, 呼吸极度困难 (数种病并发感染) 为重病猪, 治疗无望应立即淘汰。二是体温略高, 约40℃左右, 全身体况尚好, 可用大剂量猪瘟活疫苗 (10~15 头份) 1次注射。继而用抗生素或磺胺类药物及维生素C肌肉注射, 以防继发细菌感染。三是体质健壮健康良好的仔猪为假定健康猪, 立即用5 头份猪瘟活疫苗补防1次。
非典型猪瘟发生期间哺乳期内的仔猪尽量避免注射。同时要注意加强饲养管理, 搞好栏舍卫生, 仔猪进栏用猪瘟疫苗4头份肌注免疫。