香精在食品行业中被广泛应用于婴幼儿产品、糕点、饮品、糖果、巧克力中,它的特殊香味不仅弥补了食品口味的缺陷,而且降低了食品成本。香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、麦芽酚、乙基麦芽酚是食品中常用食品香味剂。至今,还没有很多香兰素对人体有害的相关报道。但是,据欧盟专家委员会报道,大剂量食用香兰素可导致头痛、恶心、呕吐、呼吸困难,甚至损伤肝、肾;而麦芽酚具有弱的致突变活性和诱导细胞死亡的毒性[1]。并且,我国GB2760-2014规定了香料的禁用范围及在婴幼儿食品中香兰素及乙基香兰素的使用限量。所以,建立一种可靠、简单、准确的香精检测方法势在必行。
目前,检测香精的方法有气相色谱法[2],气相色谱质谱法[3],毛细管区带电泳法[4],液相色谱法[5],液相色谱串联质谱法[1]。这几种方法存在检测项目少、检测成本高、检测时间长的缺点。本实验利用水超声提取后,经HLB固相萃取柱净化,通过高效液相法测定了奶粉中香兰素,香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、麦芽酚、乙基麦芽酚含量,为香精检测行业多提供一种检测方法。
1.实验部分
(1)仪器与设备
Agilent1290型超高压液相色谱仪,配有DAD检测器;
电子天平(精度0.0001g和精度0.01g)。
(2)试剂与材料
甲醇(色谱纯);
磷酸二氢钠(分析纯);
磷酸(分析纯);
固相萃取柱:MAX固相萃取柱(waters),HLB固相萃取柱(waters);
香兰素对照品(纯度98%)、甲基香兰素对照品(纯度98%)、乙基香兰素对照品(纯度98%)、麦芽酚对照品(纯度98%)、乙基麦芽酚对照品(纯度98%)。
(3)标准溶液的配制
①标准储备液(10mg﹒mL-1)分别称取香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、麦芽酚、乙基麦芽酚标准品0.1g(精确至0.0001g)置于10mL棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度,于4℃冰箱中保存。
②标准使用液(1.0mg﹒mL-1),取标准储备液1.0mL于10mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度。
(4)测定方法
①色谱条件
色谱柱AgilentSB-Aq柱(C18,150mm×2.1mm,粒径1.8μm);
检测器:Agilent二极管阵列检测器;
柱温:30℃;
流动相:甲醇+0.01mM磷酸二氢钠(磷酸调PH=2.9);
流速:1.0mL﹒min-1;
检测波长:278nm;
进样量:10μL。
②标准曲线分别取各浓度的标准使用液,在上述色谱条件下测定,以标准使用液浓度为横坐标,以相应的峰面积为纵坐标进行标准曲线的绘制。
(5)样品前处理
称取2.00g样品于离心管中,加入40mL水,超声提取30min,8000r/min离心5min,过定性滤纸,取20mL滤液,加20mL水,混匀,取20mL过HLB柱,10mL水淋洗一次,抽干,5mL 80%甲醇溶液洗脱,最后定容至5mL,过有机膜,待测。
2.结果与讨论
(1)色谱柱的选择
本实验比较了色谱柱DIKMA-Inertsil®ODS-2C18(250mm×4.6mm,5μm)、AgilentZORBAXSB-AqC18(250mm×4.6mm,5μm)和AgilentZORBAXSB-AqC18(150mm×2.1mm,1.8μm)。前者对甲基香兰素和乙基香兰素完全没有分开,粒径为5μm的AqC18柱的灵敏度明显比粒径为1.8μm的色谱柱低,考虑到降低检出限,最后选择AgilentZORBAXSB-AqC18(150mm×2.1mm,1.8μm)色谱柱作为该实验的分析柱。
(2)流动相的选择
流动相有机相比较了甲醇和乙腈,乙腈不能将五种香精完全分开,最终选择甲醇作为有机流动相。
(3)蛋白沉淀剂的选择
作为蛋白沉淀剂有多种,酸、碱、重金属、有机溶剂等。考虑到强酸强碱需要调PH值,因此本实验主要考察了重金属和有机溶剂的比较,重金属沉淀剂有CuSO4溶液+NaOH溶液、亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液,有机溶剂沉淀剂有乙醇溶液。通过回收率比较,乙醇溶液的回收率明显高于其它两种重金属沉淀剂。但是,只用乙醇沉淀蛋白后进样测试,杂峰比较多,对乙基麦芽酚的定量有影响,然后进一步采用固相萃取柱净化。本实验比较了阴离子交换柱MAX柱和既亲水又亲酯的HLB柱,通过多次实验比较,HLB几乎没有吸附,MAX柱对甲基香兰素没有吸附。最后又对HLB柱进行分析,考虑到乙醇能完全把目标物洗脱下来,然后在不加乙醇的条件下对HLB柱进行进一步分析。结果经过初步实验回收率很高。因此,在使用HLB固相萃取柱的情况下,不加蛋白沉淀剂,回收率比较高。
(4)洗脱液甲醇不同含量的比较
本实验对甲醇含量分别为:35%、50%、65%、80%、100%进行比较。当甲醇含量超过50%时,回收率趋于平稳,但是,甲醇含量越多,杂峰干扰影响越大。因此最后选择甲醇含量为80%作为洗脱溶剂。
(5)洗脱体积的比较
本实验考察了1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL不同体积的洗脱溶剂,当洗脱体积大于3mL时,回收率趋于稳定。同时考虑到洗脱完全,因此选择洗脱体积为5mL。
(6)标准曲线、线性关系、检出限和定量限
标准曲线的绘制:临用前吸取一定体积的标准储备液用甲醇逐级稀释,使其最终浓度为0.2μg﹒mL-1、0.3μg﹒mL-1、0.5μg﹒mL-1、1.0μg﹒mL-1、2.0μg﹒mL-1、4.0μg﹒mL-1、 8.0μg﹒mL-1、10.0μg﹒mL-1。分别取以上各浓度的标准使用液,在上述色谱条件下测定,以标准使用液浓度为横坐标,以相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。根据S/N=3峰面积对应的化合物含量作为检出限,检出限为2.5mg﹒kg-1,S/N=10峰面积对应的化合物含量为定量限,定量限为7.5mg﹒kg-1。其标准曲线及相关系数见表1。
(7)精密度和回收率
本实验分别在2倍定量限、4倍定量限和10倍定量限添加水平上对奶粉空白样品进行精密度和回收率测试,回收率在83.1%～88.1%之间,精密度在2.8%～7.3%之间。其结果见表2。
3.结论
奶粉样品用水超声提取,经HLB柱净化,80%的甲醇水溶液洗脱,最后用二极管阵列-UPLC检测。该方法操作简单,回收率高,同时检测5种香精,可以作为一种日常检测的检测方法。
摘要：建立了同时测定奶粉中5种香精含量的高效液相色谱法。首先对样品进行超声提取,再经HLB固相萃取柱净化。采用AgilentSB-Aq柱(C18,150mm×2.1mm,粒径1.8μm)、流动相为甲醇+0.01mM磷酸二氢钠(磷酸调PH=2.9)、流速为1.0mL﹒min-1和检测波长为278nm的色谱条件进行检测。5种香精在0.2～10μg﹒mL-1范围内线性良好,检出限和定量限分别为2.5mg﹒kg-1和7.5mg﹒kg-1,平均加标回收率在83.1%～88.1%之间,精密度在2.8%～7.3%之间。该方法操作简便,回收率高,可以作为奶粉中5种香精检验的检测方法。
关键词：高效液相色谱法,奶粉,香精
参考文献
[1] 杨华梅,杭莉.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中4种常用香精.色谱,2015,33(3):250-255.
[2] 刘玉萍.婴幼儿乳制品中香兰素的检测方法研究.湖南文理学院学报(自然科学版),2011,23(2):51-54.
[3] 赵建国,姜金斗.气相色谱质谱联用测定婴幼儿奶粉中香兰素和乙基香兰素.生命科学仪器,2013,11(10):40-44.
[4] 陈星,关瑾,等.毛细管区带电泳法同时分离测定香兰素和邻位香兰素异构体.色谱,2011,28(11):1111-1114.
[5] 孙荣华,马玉婷,等.二极管阵列反相高效液相色谱法测定蜜饯中香兰素含量.中国卫生检验杂志,2011,21(3):586-587.