维生素C大规模工业化生产采用“二步发酵法”[1], 第一步是用生黑葡糖杆菌将D-山梨醇发酵转化为L-山梨糖, 简称“一步发酵”;第二步是由氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌经适宜协调混合培养, 将L-山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸 (2-KLG) , 简称“二步发酵”。本文结合生产试验对一步发酵菌种生产工艺做进一步探讨。
1 材料与方法
1.1 菌种
生黑葡糖杆菌 (GLuconobacten melano genus俗称黑醋菌) 为江苏江山制药有限公司菌种室保藏菌种。
1.2 培养基
种液培养基, 固体培养基, 发酵瓶培养基均采用工业生产上的配方, 120℃, 0.1MPa, 灭菌30min。
1.3 一步发酵黑醋菌生产工艺流程
传统工艺:冷冻管→种液平皿上划曲线→搭茄瓶→种液→进入种子罐。
(1) 种液制备:从培养好的黑醋菌茄瓶斜面上刮1～2环, 接入装有种液培养基的摇瓶中, 180r/min, 30℃振荡培养18h～24h, 用斐林法测定山梨糖含量在100mg/mL以上, pH5.1, 镜检不染菌。
(2) 茄瓶制备:用上述种液在固体培养基 (种液平皿) 上划曲线, 30℃恒温箱培养48h, 在培养好的种液平皿上用接种针挑起聚集在一起黑醋菌菌团几环, 接入茄瓶的空白斜面上, 涂匀, 30℃恒温箱培养48h。
(3) 发酵瓶培养:按8%的接种量将种液接入发酵瓶培养基中, 180r/min, 30℃振荡培养16h、18h、24h分别从发酵瓶中取样, 用斐林法测定山梨糖含量。
1.4 分析方法
(1) 一步发酵L-山梨糖的测定:斐林法测定含糖量。 (2) 光学显微镜观察。
2 结果与讨论
2.1 优化工艺流程 (一)
冷冻管→搭茄瓶→种液→进入种子罐。
(1) 试验:用上述培养好的一步种液直接滴入茄瓶空白斜面上涂匀, 再制备种液 (如表1) 。
结果:用上述培养好的一步种液吸0.2mL直接滴入茄瓶空白斜面上较适宜。
2.2 优化工艺流程 (二)
冷冻管→分离平皿→搭茄瓶→种液→进入种子罐。
(1) 茄瓶制备:取上述种液经过无菌水稀释至10-7～10-8, 吸0.1mL稀释菌液滴入空白分离培养基平皿上, 涂匀, 30℃恒温箱培养72h。从培养好的分离平皿上挑选形态好的单个菌落几环接入空白茄瓶斜面上, 涂匀, 30℃恒温箱培养48h。
2.3 防止一步黑醋菌退化的措施
黑醋菌从斜面定期移植, 频繁的传代会加速菌种退化。为了防止黑醋菌退化, 传统工艺、优化工艺 (一) 必须定期取上述种液经过无菌水稀释至10-8～10-9, 吸0.1mL稀释菌液, 滴入空白D-葡萄糖-CaCO3培养基平皿上涂匀, 30℃恒温箱培养7d～10d。根据溶钙圈的大小来筛选圆形、直径在0.8cm～1.5cm的溶钙圈上的黑醋菌传代为佳。优化工艺 (二) 每做一批种液就从分离平皿上筛选形态好的单个黑醋菌传代, 来减少菌种退化。
2.4 上述三种一步菌种生产工艺之间的比较 (如表2)
结果: (1) 优化工艺 (一) 是在传统工艺上去除“在种液平皿上划曲线”这一步骤。 (2) 优化工艺 (二) 有分离平皿操作, 能有效防止菌种退化。
3 结语
生产试验表明在不影响菌种生产的前提下, 优化工艺 (一) 能简化菌种工艺流程又节约了生产成本。优化工艺 (二) 能有效防止菌种退化。国外报道维生素C“二步发酵法”的新工艺是利用基因工程菌将D-山梨醇直接发酵产生2-KLG, 它能大大简化工艺, 降低成本。
摘要：通过对维生素C一步发酵菌种生产工艺的优化, 可简化一步菌种生产工艺流程和有效地防止菌种衰退, 降低生产成本。
关键词：维生素C,黑醋菌,一步发酵,培养基,种液,茄瓶
参考文献
[1] 尹光琳, 陶增鑫, 严自正, 等.维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的优良菌株的筛选[J].微生物学报.1980, 20 (3) :246～251.